陶玉貴，孫憶晨，曹 寧，葛 飛

(安徽工程大學生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

磁性納米顆粒作為一種納米材料在生物技術和生物制藥等領域已顯出良好的應用前景［1］，如生物活性物質(zhì)的固定和修飾，靶向藥物以及生物活性物質(zhì)的檢測等［2-3］。合成生物相容磁性納米微粒的方法主要有共沉淀法［4］、氣溶膠法［5］、微乳液法［6］等。但是物理或化學方法制備的磁性納米顆粒尺寸分布較寬、在溶液中易發(fā)生聚集，使其失去納米材料所特有的性質(zhì)［7］。因此，通過生物方法得到粒徑分布范圍窄、操作簡單和成本低的磁性納米顆粒是人們關注的重點［8］。趨磁細菌是一類能夠?qū)h(huán)境中鐵元素礦化為積累在細胞內(nèi)由生物膜包被的、納米尺寸、單磁疇級別晶體顆粒的微生物［9］，由該方法得到磁性納米顆粒能夠很好地滿足較窄的粒徑分布范圍等要求［10-11］，是一種非常理想的納米載體［12］。目前的研究表明，大多數(shù)趨磁細菌需要在微好氧或厭氧條件下生長，且營養(yǎng)條件要求苛刻［13］，因此在實驗室中能夠分離純化得到的細菌種類很少，限制了對其的進一步研究。Magnetospirillum sp.AMB-1是 Matsunaga等［14］從日本東京天然淡水泉沉積物中分離得到的1株螺旋形趨磁細菌，是目前為數(shù)不多的幾種能在實驗室條件下大量培養(yǎng)的細菌，其耐氧度高，能夠利用三羧酸循環(huán)的中間體作為生長所需的碳源，并可在微好氧或厭氧條件下合成Fe3O4型磁小體。但由于其所需的生長條件較為苛刻，因此，大量的純種培養(yǎng)及合成較多的磁小體仍然是目前亟待解決的問題［15］。本文在前期所做的單因素實驗基礎上，利用響應面法優(yōu)化趨磁細菌Magnetospirillum sp.AMB-1產(chǎn)磁小體的條件，所有的實驗設計、數(shù)據(jù)處理以及響應面模型的建立均使用SAS軟件進行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 趨磁細菌 Magnetospirillum sp.AMB-1，購于美國標準菌種保藏所，菌種編號為ATCC700264。

1.1.2 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，均為MSGM 培養(yǎng)基［16］。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①平板培養(yǎng):將趨磁細菌Magnetospirillum sp.AMB-1進行平板培養(yǎng)，30℃條件下培養(yǎng)96 h;②種子培養(yǎng):250 mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基125 mL，接入平板培養(yǎng)基上的細菌，30℃下培養(yǎng)4 d;③發(fā)酵培養(yǎng):通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的添加量，于250 mL錐形瓶中裝入125 mL培養(yǎng)基，并按2%的接種量，在不同培養(yǎng)條件下依次進行Plackett-Burman、最陡爬坡實驗和響應面實驗。

1.2.3 實驗設計 ①Plackett-Burman實驗:根據(jù)單因素實驗結果，選取6個影響因素，進行8次實驗，并對其重要性進行篩選(自變量、編碼和水平因素見表1);②最陡爬坡實驗:根據(jù)Plackett-Burman實驗結果設計最陡爬坡路徑，增加或減少重要因素在培養(yǎng)基中的濃度，其余因素均為初始水平，考察發(fā)酵液中菌體量與磁小體形成量的變化趨勢，確定重要因素的最適濃度范圍［18-19］;③Box-Behnken實驗:以Plackett-Burman實驗篩選得到的對發(fā)酵液中菌體量和磁小體形成量影響顯著的因素作為設計因素，以最陡爬坡實驗得到的最佳條件為中心點，根據(jù)相應的實驗表進行實驗，使用SAS軟件對實驗結果進行響應面分析(見表2)。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken實驗因素與水平Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 實驗

Plackett-Burman實驗結果見表3，并采用SAS軟件對表3中的菌種量和磁小體形成量進行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性(見表4)。實驗結果表明，奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH值對菌種濃度影響較大，且影響均為正效應。而pH和培養(yǎng)溫度對磁小體形成量并無太大影響，奎尼酸鐵添加量對其影響呈現(xiàn)正效應。根據(jù)實驗結果綜合考慮，選擇奎尼酸鐵添加量、pH和溫度進行進一步的優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實驗設計結果Table 3 Plackett-Burman experimental design and response values

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 4 Partial regression coefficients and analysis of their significances

2.2 最陡爬坡實驗確定最佳濃度范圍

如表5所示，在奎尼酸鐵添加量為 0.25 μmol，培養(yǎng)溫度為32℃，pH為6.7的實驗條件下，趨磁細菌量和磁小體形成量均達到最大值，以該實驗條件作為中心點，進行下一步優(yōu)化實驗。

表5 最陡爬坡路徑實驗設計及結果Table 5 The path of steepest ascent experimental design and response values

2.3 利用響應面分析法確定最佳實驗條件

以奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH 3個重要因素為自變量，各個因素水平見表2，Box-Behnken實驗設計及結果如表6所示。

表6 Box-Behnken實驗設計及結果Table 6 Box-Behnken experimental design and response values

根據(jù)表6的實驗結果，利用SAS軟件處理后得到回歸方程。菌種濃度的回歸方程:Y1=0.974667+0.00025 × A+0.005375 × B-0.00375×C-0.008208×A ×A+0.0005×A ×B+0.0025×A ×C-0.022458×B ×B-0.00325×B ×C-0.039458×C ×C

磁小體形成量的回歸方程:Y1=1.782333+0.0035 × A+0.004375 × B-0.003875 × C-0.003417×A×A+0.00075 ×A ×B+0.00125×A×C-0.017667×B ×B-0.0025×B ×C-0.050167×C ×C。

其中A、B、C分別代表奎尼酸鐵添加量、pH值和培養(yǎng)溫度(表7)。方差分析顯著性結果表明，R2分別為99.62%和99.03%，方程的回歸性顯著。

表7 回歸分析結果Table 7 Results of regression equation analysis

利用SAS軟件對回歸模型進行響應面分析，得到各響應面立體分析圖(圖1，圖2)。對上述2個回歸方程求偏導，得到模型極值點，綜合考慮后取奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH分別為2.7 μmol，32 ℃和 6.8，該條件下菌體濃度和磁小體形成量達到最大值。

圖1 因素對菌體濃度交互影響三維曲面圖Fig.1 Surface of mutual-influence on the yield of magnetotacic bacteria AMB-1

圖2 因素對磁小體形成量交互影響三維曲面圖Fig.2 Surface of mutual-influence on the production of magnetosomes

2.4 優(yōu)化結果驗證

為了驗證模型的正確性，在預測的最佳培養(yǎng)條件下進行了3次發(fā)酵實驗，所得的菌體濃度和磁小體形成量分別為 0.980 à、1.782，與預測值接近，說明該模型能夠很好地預測其發(fā)酵情況。

3 討論

采用響應面分析法對趨磁細菌產(chǎn)磁小體的條件進行優(yōu)化，首先運用Plackett-Burman法確定出奎尼酸鐵添加量、初始pH和培養(yǎng)溫度為重要影響因素，然后通過最陡爬坡實驗逐步改變?nèi)叩臐舛?，逼近最佳響應面區(qū)域;最后采用Box-Behnken設計及SAS軟件分析確定除了主要影響因素的最佳濃度，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為奎尼酸鐵添加量 2.7 μmol、培養(yǎng)溫度 32℃ 和 pH 6.8。同時進行了實驗驗證，通過回歸方程所得到的最大預測值與驗證值非常接近，說明該回歸方程能夠比較真實地反映各篩選因素對培養(yǎng)條件的影響，由此方法建立的模型與實際情況比較吻合，從對Cmag值測定的結果表明Cmag值與菌體濃度存在一定的關系，當菌體濃度增加時，單位發(fā)酵液中所含有的磁小體量也有一定程度的增加，因此用響應面法優(yōu)化趨磁細菌產(chǎn)磁小體條件是可行的。

［1］陳彥平，郭芳芳，姜偉，等.趨磁螺菌納米磁小體的特征及標準化檢測體系［J］.東南大學學報，2011，30(1):47-51.

［2］劉聰，李穎，李季倫，等.抗氧化酶過表達對趨磁螺菌MSR-1耐氧性的影響［J］.生物技術通報，2010，(10):215-220，230.

［3］Atsushi Arakaki，F(xiàn)ukashi Masuda，Yosuke Amemiya，et al.Control of the morphology and size of magnetite particles with peptides mimicking the Mms6 protein from magnetotactic bacteria［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2010，343(1):65-70.

［4］Sangmoon Park.Preparation of iron oxides using ammonium iron citrate precursor:Thin films and nanoparticles［J］.Journal of Solid State Chemistry，2009，6(27):2456-2460.

［5］Sebahattin Gurmen，Burcak Ebin.Production and characterization of the nanostructured hollow iron oxide spheres and nanoparticles by aerosol route［J］.Journal of Alloys and Compounds，2010，492(1-2):585-589.

［6］Amir Hassanjani-Roshan，Mohammad Reza Vaezi，Ali Shokuhfar，et al.Synthesis of iron oxide nanoparticles via sonochemical method and their characterization［J］.Particuology，2011，9(1):95-99.

［7］Alfonso F.Davila，Michael Winklho fer，Valer a P.Shcherbakov，et al.Magnetic Pulse Affects a Putative Magnetoreceptor Mechanism［J］.Biophysical Journal，2007，89(1):56-63.

［8］Robert D.Boyd，Siva K.Pichaimuthu，Alexandre Cuenat.New approach to inter-technique comparisons for nanoparticle size measurements;using atomic force microscopy，nanoparticle tracking analysis and dynamic light scattering［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，2011，387(1-3):35-42.

［9］Jonathan R Llovd，James M Byrne，Victoria S Coker.Biotechnological synthesis of functional nanomaterials［J］.2011，22(4):509-515.

［10］孫長江，尹曉紅，馬偉，等.趨磁細菌培養(yǎng)及用于吸附分離貴重金屬離子［J］.微生物學通報，2010，37(3):394-400.

［11］李金華，潘永信，劉青松，等.趨磁細菌Magnetospirillum mag-neticum AMB-1全細胞和純化磁小體的磁學比較研究［J］.科學通報，2009，54(21):3345-3351.

［12］劉新星，武海艷，林文斌，等.氧化亞鐵硫桿菌中磁小體形成相關基因在不同亞鐵濃度刺激下的差異表達［J］.生物工程學報，2009，25(1):69-75.

［13］Jonathan P.Gramp，Jerry M.Bigham，F(xiàn).Sandy Jones，et al.Formation of Fe-sulfides in cultures of sulfate-reducing bacteria［J］.Journal of Hazardous Materials，2010，175(1-3):1062-1067.

［14］Matsunaga T，Sakaguchi T，Tadokoro F.Magnetite Formation by A Magnetic Bacterium Capable of Growing Aerobically［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，1991，35(5):661-655.

［15］張宇紅，肖天.高磁性與無磁性趨磁細菌的獲得及磁小體釋放技術研究［J］.實驗與技術，2009，33(2):1-4，10.

［16］Atsushi Arakaki，F(xiàn)ukashi Masuda，Yosuke Amemiya，et al.Control of the morphology and size of magnetite particles with peptides mimicking the Mms6 protein from magnetotactic bacteria［J］.Journal of Colloid and Interface Science，2010，343(1):65-70.

［17］Schüler D，Uhl R，B?uerlein E.A simple light scattering method to assay magnetism in Magnetospirillum gryphiswaldense［J］.FEMS Microbiology Letters，1995，132(1-2):139-145.

［18］徐婷婷，高明，呂淑霞，等.響應面法優(yōu)化Vc二步法酵新菌系產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的培養(yǎng)基［J］.微生物學雜志，2012，32(2):47-53.

［19］藍麗精，蔡琪敏，宋迤明，等.草酸青梅液體發(fā)酵產(chǎn)果膠酶［J］.微生物學雜志，2011，31(7):36-41.