張小勇， 黃成澤， 朱愛花， 崔勝云

（延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

鄰苯二甲醛同步熒光衍生化法測定微量指血中還原型谷胱甘肽

張小勇， 黃成澤， 朱愛花， 崔勝云*

（延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林 延吉133002）

采用微升（μL）級微量指血為檢測樣品，在未對樣品去蛋白的條件下，用鄰苯二甲醛（OPA）熒光衍生化法測定了微量靜脈血中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量．利用標準曲線法和標準加入法進行3次測定的均值分別為4．415μmol/L和5．417 5μmol/L，加標回收率為95．28%～97．18%，檢測限為3．6×10－8mol/L，可基本滿足微量成分分析所要求的準確度．本研究為靈敏、簡便和快速測定微量血樣中GSH的含量提供了實驗和方法學的依據(jù)．

谷胱甘肽；鄰苯二甲醛；熒光光度法；衍生化

0 引言

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激和亞硝化應激與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展具有密切的關聯(lián)，氧化應激產(chǎn)生的活性氧和亞硝基化產(chǎn)物對生物大分子的破壞作用是疾病產(chǎn)生的直接原因之一．為了確定生物體內(nèi)的氧化應激和亞硝化應激狀態(tài)，通過檢測生物標記物質(zhì)來確定生物體內(nèi)氧化應激和亞硝化應激的狀態(tài)具有十分重要的意義．目前，廣泛采納的生物標記物質(zhì)包括蛋白質(zhì)的碳?；a(chǎn)物、脂質(zhì)過氧化物、亞硝基化的巰基產(chǎn)物、還原型谷胱甘肽等［1－3］．還原型谷胱甘肽（GSH）在生物體內(nèi)廣泛分布，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的含硫醇三肽化合物，是指示生物體氧化應激和亞硝化應激的重要生物標記物質(zhì)［4－6］．因此，準確、簡便、靈敏地測定生物體內(nèi)的GSH，對防病、治病具有重要的意義．

血液中的GSH濃度分布是衡量人體氧化應激的重要指標．目前，測定血液中GSH含量的大多數(shù)方法通常樣品用量較多，給應試者帶來不適，同時分析時需要除蛋白等前處理過程，操作較為繁瑣．本文采用微量指血為檢測樣品，在未對樣品去蛋白的條件下，利用鄰苯二甲醛（OPA）同步衍生化熒光分析法測定了微量靜脈血樣中GSH的含量，其結果令人滿意．

1 實驗部分

1．1 儀器和試劑

RF－5301PC熒光分光光度儀（島津公司），UV－8500紫外分光光度儀（天美公司），UP－400S超聲波細胞粉碎機，KQ－500DE數(shù)控超聲波清洗機，p HS－3C型實驗室酸度計；還原型谷胱甘肽（Sigma公司），鄰苯二甲醛等其他試劑均為分析純．

1．2 樣品處理

利用微量注射器針刺取靜脈指血5μL，然后分別移入含有一定濃度OPA衍生化試劑的PBs緩沖液（p H＝8）的離心管A及含一定濃度GSH的標準液B中，進行同步超聲破壁衍生化反應．根據(jù)A管中樣品的熒光強度利用標準曲線法測定GSH的含量．根據(jù)B管中樣品的熒光強度與加標GSH的濃度，利用標準加入法確定GSH的含量．所有測試過程均在熒光比色皿中完成，流程如圖1所示．

圖1 指血樣品采集流程圖

1．3 分析方法

GSH中半胱氨酸的硫醇基和谷氨酸上的氨基可與鄰苯二甲醛（OPA）上的2個醛基縮合成可發(fā)強熒光的三環(huán)共軛結構的衍生化產(chǎn)物，見圖2［7］．由于衍生化反應速率較快，衍生化產(chǎn)物發(fā)射的熒光強度與GSH的濃度呈良好的線性關系，因此可采用校正法測定樣品中的GSH含量．

圖2 OPA和GSH的衍生化反應

2 結果與討論

2．1 熒光衍生化反應和測定條件

利用Uv－vis吸收光譜儀，在PBs緩沖溶液中分別測定一定濃度的OPA、GSH及兩者混合溶液的吸收光譜（見圖3A）．如圖3A所示，GSH標準溶液和OPA溶液在波長320 nm以上沒有吸收值，但兩者的混合液在波長340 nm和350 nm處有明顯的吸收峰和吸收肩峰，說明兩者作用生成共軛度較OPA高的衍生化產(chǎn)物．為了確定GSH和OPA衍生化產(chǎn)物的激發(fā)波長和熒光波長，采用上述GSH和OPA混合溶液，利用熒光光譜儀，在200～600 nm范圍內(nèi)，對樣品進行激發(fā)和發(fā)射波長全掃描．結果發(fā)現(xiàn)：衍生化產(chǎn)物出現(xiàn)最大吸收肩峰波長處，即λex＝350 nm作為激發(fā)波長時，在λem＝429 nm處得到最靈敏、等強度的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜曲線（見圖3B），說明激發(fā)波長為350 nm時熒光量子產(chǎn)率最高．因此，本實驗選取λex＝350 nm為激發(fā)波長．

2．2 OPA和GSH選擇性衍生化反應

為了探討GSH和OPA選擇性衍生化反應，分別選擇血樣中可能共存的小分子干擾組分，如半胱氨酸、抗壞血酸、尿酸與OPA的混合溶液等進行衍生化處理，然后利用Uv－vis吸收光譜儀和熒光光譜儀測定其光譜圖，并與GSH和OPA混合溶液的光譜圖進行比較，結果如圖4所示．

圖3 A為GSH［（1），1×10－4 mol/L］、OPA［（2），1×10－3 mol/L］以及混合溶液（3）的Uvvis吸收光譜；B為GSH和OPA混合溶液的熒光光譜圖

圖4 A為OPA（1×10－3 mol/L）與GSH（1×10－4 mol/L）（1）、尿酸（1×10－4 mol/L）（2）、抗壞血酸（1×10－4 mol/L）（3）、半胱氨酸（1×10－4 mol/L）（4）混合溶液的Uv－vis吸收光譜；B為OPA與GSH（1）、尿酸（2）、抗壞血酸（3）、半胱氨酸（4）混合液的熒光光譜圖

如圖4所示，除GSH之外，尿酸、半胱氨酸、抗壞血酸在吸收波長大于320 nm時，無明顯的吸收峰；當激發(fā)波長為350 nm時，除GSH外也均無明顯的熒光發(fā)射．這說明只有GSH和OPA生成熒光衍生化產(chǎn)物，而尿酸、半胱氨酸、抗壞血酸不生成熒光衍生化產(chǎn)物．因此，本實驗條件下OPA為GSH的選擇性熒光衍生化試劑．

2．3 熒光分光光度法測定GSH

分別在PBs緩沖溶液（p H＝8）和過量OPA溶液中配置不同濃度的GSH標準系列溶液，選定激發(fā)波長為350 nm記錄熒光發(fā)射光譜，并用最大發(fā)射波長（429 nm）處的熒光發(fā)射強度對GSH的濃度做校正曲線，結果見圖5．如圖5所示，GSH濃度與熒光發(fā)射強度呈良好的線性關系，檢測限達5×10－8mol/L．標準曲線的回歸方程為If＝－0．055 06＋3．724 1 C，相關系數(shù)R＝0．999 26．

圖5 在1×10－3 mol/L OPA溶液中依次加入不同濃度的GSH時，熒光強度與GSH濃度之間的關系圖

圖6為采用指血樣品，在過量OPA（1×10－3mol/L）溶液中對樣品進行衍生化處理，然后依次加入不同濃度的GSH標準溶液后所測得的熒光光譜圖和最大發(fā)射波長處的熒光發(fā)射強度與GSH標準溶液間的線性關系圖．如圖6A所示，血液樣品空白（未加OPA的超聲破壁的血樣）和OPA溶液在該實驗條件下沒有明顯的熒光發(fā)射峰，說明樣品中基體成分基本不干擾本測定．但在血樣中加入OPA衍生化試劑后，在λem＝429 nm處出現(xiàn)靈敏的熒光發(fā)射峰，說明樣品中含有GSH．當在樣品中加入濃度漸增的GSH標準溶液后，λem＝429 nm處的發(fā)射強度與加入的GSH濃度呈良好的線性關系，其線性回歸方程為If＝6．310 54＋0．584 24 C，相關系數(shù)R＝0．997 4．

分別利用標準曲線法和標準加入法測定樣品中GSH的含量和回收率，并把測定結果與文獻［8］的結果（血色素中GSH的含量）進行比較（見表1）．表1結果表明，標準加入法所測得的結果高于標準曲線法，這主要是由基體干擾所致．本方法測定的結果雖低于文獻［8］的值，但測定結果在同一個數(shù)量級上，具有一定的可比性．兩種方法測定結果出現(xiàn)差別的原因可能是由于文獻［8］測定的血樣為動脈血，而本實驗測定的血樣為靜脈血．

圖6 在指血樣品OPA提取中依次加入不同體積的加標液時，體系中GSH濃度與熒光強度之間的關系圖（圖A中（1）為OPA空白，（2）為血樣空白溶液的熒光光譜圖）

表1 標準曲線法與加入法測定指血中GSH含量的結果

3 結論

本文采用微升級的微量靜脈指血為檢測樣品，不經(jīng)過去蛋白前處理過程，用熒光衍生化法靈敏測定了微量血樣中GSH的含量．本方法測定的結果與文獻［8］中色譜法敞亮血樣測定的結果基本吻合，方法的檢測限為5×10－8mol/L．由于采樣少，簡化了前處理操作，因此本方法是一種簡便、實用、經(jīng)濟、靈敏的分析方法，可為血樣快速分析提供方法學依據(jù)．

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Glutathione determination by finger blood sampling using o－phthaladehyde as fluorescent derivatizing agent

ZHANG Xiao－yong， HUANG Cheng－ze， ZHU Ai－h(huán)ua， CUI Sheng－yun＊
（Key Laboratory of Natural Resources of the Changbai Mountain ＆Functional Molecules（Yanbian University），Ministry of Education，Yanji 133002，China）

Reduced glutathione is sensitively determinined by fluorescent spectrometry using o－phthalaldehyde（OPA）as fluorescent derivatizing agent and different calibration methods by micro sampling of finger blood without protein elimination．The average amounts of GSH determined by calibration and standard addition methods are 4．415μmol/L and 5．417 5μmol/L respectively，recoveries are in the range of 95．28%－97．18%，detection limits is 3．6×10－8mol/L．The methods is suitable for simple，rapid and sensitive determination of GSH in micro blood sample．

glutathione；o－phthaladehyde；fluorescent spectrometry；derivatization

O652

A

1004－4353（2012）02－0146－04

2012－06－07 ＊通信作者：崔勝云（1957—），男，教授，研究方向為生物分析化學．

國家自然科學基金資助項目（21165021）；吉林省教育廳項目（吉教科合字2010D273）