張利燕，常 虹 ，趙麗芹，周家華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京 100097）

理化因素對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響研究

張利燕1，2，常 虹2，*，趙麗芹1，周家華2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010018;

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京 100097）

本文從板栗花雄花序中提取黃酮類化合物，采用紫外分光光度法研究理化因素對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響。結(jié)果表明:自然光對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力有影響;溫度對(duì)其影響不明顯;在pH3～5的弱酸性條件下清除DPPH自由基的能力較高，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液中清除DPPH自由基的能力較低;金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+對(duì)其清除DPPH自由基能力的影響不明顯，Al3+影響較明顯。

理化因素，黃酮，清除力，DPPH自由基

花粉集中了植物體的精華，營養(yǎng)十分豐富，在國際上有“完全營養(yǎng)品”、“微型營養(yǎng)庫”之稱，是天然的綠色營養(yǎng)品。板栗花為殼斗科（Fagceae）栗屬植物栗（Castanea mollissima Blμme）的雄性花序，其花粉含豐富的活性鈣、磷、維生素E、雌二醇、黃酮、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)［1］。板栗花雄花序可以增強(qiáng)血管張力、降低血管脆性、改善血管通透性、降低血脂及膽固醇;減少紅血球和血小板聚集、減少血栓的形成;護(hù)肝解毒、提高機(jī)體免疫力;抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制腫瘤等［2－3］。在食品、藥品、保健品、化妝品等諸多領(lǐng)域具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。板栗花中的黃酮物質(zhì)是所有花粉中含量最高的［4］，凝聚了天然、綠色、營養(yǎng)、保健等特點(diǎn)。研究表明:黃酮類物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗過敏、抗衰老、抗腫瘤及降血脂等多種生物活性;此外，黃酮類物質(zhì)還是一種天然的自由基清除劑。人體在新陳代謝過程中，隨著氧的消耗會(huì)生成許多自由基，這些自由基是許多生理和病理過程的積極參與者，對(duì)機(jī)體危害極大。因此尋找安全高效的天然自由基清除劑受到國內(nèi)外的重視。目前，已經(jīng)開發(fā)出了一些天然的自由基清除劑，但是，這些天然的自由基清除劑在何種理化條件下能發(fā)揮最大的清除能力還沒有報(bào)道。本文研究了理化因素對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響，為科學(xué)合理地利用天然自由基清除劑使其發(fā)揮最大自由基清除效能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗花雄花序 2011年7月采于河北懷柔，自然陰干;DPPH（2，2－dipheny－l 1－picrylhydrazyl） 分析純，美國SIGMA公司;氯化鈉、氯化鉀、氯化鐵 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氯化鈣、硫酸鎂、硝酸鋁 分析純，西隴化工股份有限公司;無水乙醇 分析純，北京化工廠。

TU－1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LP－503電子天平 常熟市衡器廠;R－201型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 配有SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，上海申科機(jī)械研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板栗花雄花序黃酮類化合物的提取 采用乙醇熱回流浸提法提取板栗花雄花序中的黃酮類化合物［5］。乙醇濃度 70%，浸提溫度 60℃，料液比 1∶20，回流提取2次，每次2h，除去殘?jiān)笮D(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。濃縮溶液經(jīng)真空冷凍干燥得到板栗花雄花序黃酮提取物樣品，放入干燥器中備用。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的測定 在Bao等［6］所建立方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，用60%乙醇配制質(zhì)量濃度為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL的Trobx溶液，DPPH用60%的乙醇配制成2×10－4mol/L的溶液。取1mL不同濃度的樣品溶液與4mL 2×10－4mol/L的DPPH溶液于具塞試管中，搖勻反應(yīng)30min后，于517nm處測定吸光度值，用60%乙醇溶液作參比。取3次實(shí)驗(yàn)的平均值計(jì)算清除率。

式中:A1表示4mL 2×10－4mol/L DPPH溶液加入1mL60%乙醇溶液的吸光度;A2表示4mL 2×10－4mol/L DPPH溶液加入1mL樣品溶液的吸光度。1.2.3 自然光對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響 用60%乙醇配制質(zhì)量濃度為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22mg/mL的Trobx溶液，分成兩組，一組放在自然光照下，一組放在避光處，連續(xù)3d測定其對(duì)DPPH自由基的清除能力。

1.2.4 溫度對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響 準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的Trobx溶液25mL共8份，置密閉容量瓶中，分別在30、40、50、60、70、80、90、100℃ 的水浴條件下保溫30min，冷卻至室溫后測定其清除DPPH自由基的能力。

1.2.5 pH對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響 準(zhǔn)確量取質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的Trobx溶液25mL共10份，用1mol/L HCl、NaOH調(diào)至其 pH 為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，然后測定其清除DPPH自由基的能力。

1.2.6 金屬離子對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響［7］配制濃度為0.1mol/L的 K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Al3+，0.3mg/L 的 Fe3+溶液，在50mL 0.2mg/mL的Trobx溶液中分別加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL 的各種金屬離子溶液，混勻，放置1、24h后分別測定其對(duì)DPPH自由基的清除能力。

1.2.7 氧化劑、還原劑對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響 準(zhǔn)確量取50mL 0.2mg/mL的Trobx溶液10份，分別加入體積分?jǐn)?shù)均為 0.01mL 的 H2O2、Na2SO30.05、0.10、0.15、0.20、0.25mL，混勻，放置1、24h后分別測定其對(duì)DPPH自由基的清除能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力

DPPH法［8］自上世紀(jì)五十年代開始就用于天然產(chǎn)物的H－供體測定，后用于單一抗氧化物或天然物質(zhì)的抗氧化能力測試。DPPH是一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基，溶于甲醇、乙醇等極性溶劑中，在517nm處有最大吸收，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的單電子由于被配對(duì)，會(huì)發(fā)生脫色反應(yīng)，因此可用吸光度的變化并以Trolox等作為對(duì)照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。其對(duì)DPPH自由基的清除能力用IC50表示［9］。本研究利用該法來測定板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力及理化因素對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響。

圖1顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著試樣濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力增大，并且濃度和清除率有很好的量效關(guān)系。半數(shù)抑制濃度IC50為0.068mg/mL，由此可見，板栗花雄花序黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力很強(qiáng)，是一種很好的天然抗氧化劑，可以添加到食品、藥品或保健品等中。

圖1 板栗花雄花序黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除Fig.1 Flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.2 自然光對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響

圖2、圖3顯示，在自然光照條件下，隨存放時(shí)間的延長其清除DPPH自由基的能力降低;在避光條件下，隨存放時(shí)間的延長其清除力降低減緩。表明自然光對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物有降解作用，因此，板栗花雄花序黃酮提取物應(yīng)避光保存，作為抗氧化劑或自由基清除劑添加到食品或保健品等中時(shí)［10］，其相應(yīng)的食品或保健品等最好避光存放，以使板栗花雄花序黃酮提取物在食品或保健品存放過程中發(fā)揮其更大的抗氧化或自由基清除作用，延長食品或保健品的貯藏期，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

圖2 自然光下板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.2 Flavonoid extractied from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical in the natural light

圖3 暗光下板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力Fig.3 Flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical in the dim light

2.3 溫度對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響

圖2、圖3表明，板栗花雄花序黃酮提取物的濃度達(dá)到0.18mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率最大，之后隨Trobx溶液濃度的增大清除率趨于穩(wěn)定。為了計(jì)算方便及減小系統(tǒng)誤差選擇0.2mg/mL的Trobx溶液做理化因素對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響。圖4表明，隨著加熱溫度的升高，板栗花雄花序黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率變化不明顯。因此，溫度對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力沒有影響，板栗花雄花序黃酮提取物可作為天然抗氧化劑或自由基清除劑添加到需要熱處理的食品、保健品等中。

圖4 溫度對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.4 Temperature influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.4 pH對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響

圖5表明，在pH3～5的弱酸性條件下，板栗花雄花序黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除力較高;在強(qiáng)酸性條件下，其對(duì)DPPH自由基的清除力減小;在強(qiáng)堿性條件下其對(duì)DPPH自由基的清除力降到較低。因此，板栗花雄花序黃酮提取物適合添加在弱酸性的食品、保健品等中，以發(fā)揮其最大功效。

圖5 pH對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.5 pH influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.5 金屬離子對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響

圖6～圖11 表明，放置 1、24h 后，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力影響不明顯。Al3+對(duì)其影響較明顯，放置1h后，隨著Al（NO3）3添加量的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除力逐漸降低;放置24h后，隨著Al（NO3）3添加量的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除力降得更低。因此，板栗花雄花序黃酮提取物作為抗氧化劑或自由基清除劑使用時(shí)，應(yīng)避免與Al3+接觸，以免影響其抗氧化能力。

圖6 NaCl對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.6 NaCl influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

2.6 氧化劑、還原劑對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響

圖12、圖13表明放置1、24h后氧化劑H2O2對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基的能力沒有影響。還原劑Na2SO3的添加量為0.05、1mL時(shí)對(duì)其清除DPPH自由基的能力沒有影響。當(dāng)添加量大于1mL時(shí)，放置1h后，其清除力降低較明顯，隨添加量的增加其清除力逐漸降低，再放置24h后其清除力有所回升。因此，板栗花雄花序黃酮提取物在

圖7 KCl對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.7 KCl influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

圖8 MgSO4對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.8 MgSO4influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

圖9 Al（NO3）3對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.9 Al（NO3）3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

圖10 CaCl2對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.10 CaCl2influence on flavonoid extraced from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

圖11 FeCl3對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.11 FeCl3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free

圖12 氧化劑H2O2對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.12 Oxidizer（H2O2）influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

圖13 還原劑（Na2SO3）對(duì)板栗花雄花序黃酮提取物清除DPPH自由基能力的影響Fig.13 Reducing agent Na2SO3influence on flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

使用過程中應(yīng)盡量避免與過量還原劑接觸。

3 結(jié)論

3.1 板栗花雄花序黃酮提取物具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，是一種很好的天然抗氧化劑，可以添加到食品、藥品、保健品等中。

3.2 板栗花雄花序黃酮提取物作為天然抗氧化劑或自由基清除劑使用時(shí)，可以添加到含有礦物質(zhì)K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+及需要熱處理的食品、藥品、保健品等中，這些理化因素對(duì)其抗氧化性能的發(fā)揮沒有影響。

3.3 板栗花雄花序黃酮提取物作為抗氧化劑或自由基清除劑添加到食品、藥品、保健品等中時(shí)，最好選擇微酸性、不含Al3+、不添加Na2SO3的食品、藥品、保健品等中，以發(fā)揮其最大效能。板栗花雄花序黃酮提取物應(yīng)避光保存，延長其抗氧化性能。

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Research on influence of physical and chemical factors to flavonoid extract of the male chestnut
flowers’s scavenging ability to DPPH free radical

ZHANG Li－yan1，2，CHANG Hong2，*，ZHAO Li－qin1，ZHOU Jia－h(huán)ua2
（1.Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China;2.Institute of Agricultural
Integrated Development，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

The influence of physical and chemical factors to flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability of DPPH free radical was studied by Ultraviolet spectrophotometry.The results showed that the natural light had influence to flavonoid extracted from the male chestnut flowers’s scavenging ability to DPPH free radical.The effect of temperature was not obvious.The scavenging ability of DPPH free radical was superior in the acidic condition of pH3～5，and the scavenging ability of DPPH free radical was lower in the strong acid and alkali solution.The effect of metal ions，Na+，K+，Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+on scavenging ability of DPPH free radical was not obvious.But the effect of Al3+was obvious.

physical and chemical factors;flavonoid;scavenging ability;DPPH free radical

TS255.1

A

1002－0306（2012）17－0081－05

2012－01－13 *通訊聯(lián)系人

張利燕（1986－），女，碩士研究生，研究方向:功能成分提取及應(yīng)用研究。

北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金（QN201117）。