王曉云，金風(fēng)杰，計芬芬，常忠義，高紅亮，*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2.上海市紡織科學(xué)研究院，上海 200082）

補加氨水對薛氏丙酸桿菌分批發(fā)酵及代謝物抑菌活性的影響

王曉云1，金風(fēng)杰1，計芬芬2，常忠義1，高紅亮1，*

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2.上海市紡織科學(xué)研究院，上海 200082）

研究了在分批發(fā)酵過程中補加氨水對1株薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii）發(fā)酵及其代謝物對惡臭假單胞菌（Pseudomonas pudia）抑菌活性的影響。結(jié)果表明，薛氏丙酸桿菌代謝物在初始pH7.0時抑菌活性最高，為7.59AU/mL，顯著高于其他實驗組（p＜0.05）；每隔24h補加10%氨水溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH6.0時，薛氏丙酸桿菌的生物量和代謝物的抑菌活性都最大，分別為9.62mg/mL和16.42AU/mL；研究分別從第2、3或4d補加10%氨水開始調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH6.0時發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵第2d開始調(diào)節(jié)pH效果最好，生物量和代謝物的抑菌活性分別達(dá)到9.55mg/mL和16.47AU/mL。這些結(jié)果表明，在分批發(fā)酵過程中補加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH可以顯著提高丙酸桿菌代謝物的抑菌活性。

薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium.shermanii），氨水，抑菌活性

目前食品工業(yè)常用的防腐劑主要有苯甲酸鈉和山梨酸鉀等。然而越來越多的研究表明山梨酸鉀等化學(xué)合成防腐劑對人體都有潛在的毒副作用[1-2]。細(xì)菌素作為一種天然的防腐劑開始引起人們的關(guān)注。它是一種多肽，進(jìn)入人體的消化道后，可以被消化道內(nèi)的各種蛋白酶消化掉[3]。與常用的化學(xué)防腐劑相比，具有無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性的優(yōu)點，并可以抑制或殺死一些食品腐敗菌[4]。目前研究最多的細(xì)菌素是乳酸鏈球菌素（Nisin）[5]，作為天然微生物防腐劑已被多個國家批準(zhǔn)使用，其對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，對革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌則沒有明顯的抑制作用[6]。丙酸桿菌素卻有廣泛的抑菌作用，不僅能抑制革蘭氏陰性細(xì)菌、部分革蘭氏陽性菌、霉菌和酵母的生長[7]，且它是由乳品丙酸桿菌代謝產(chǎn)生，符合現(xiàn)代綠色食品無毒副作用的要求，因而作為食品防腐劑具有很大的潛力。國外已經(jīng)報道的丙酸桿菌素有5種[8]，即丙酸桿菌素PLG-1、丙酸桿菌素G、丙酸桿菌素T1、丙酸桿菌素JenseniiG和丙酸桿菌素SM 1。法國羅地亞公司開發(fā)的一種新型生物防腐劑MicrogardTM[9-10]，已被美國醫(yī)藥和食品管理局（FDA）批準(zhǔn)為防腐劑用于食品中，而M icrogardTM是謝氏丙酸桿菌的發(fā)酵代謝物。近年來國內(nèi)在對丙酸桿菌進(jìn)行菌種分離、鑒定與產(chǎn)酸的基礎(chǔ)上也開始對其發(fā)酵條件[3，11-12]進(jìn)行初步探索，包括碳源、氮源的選擇，補料對發(fā)酵的影響等，馬悅培[13]等人還對發(fā)酵環(huán)境的pH影響進(jìn)行了一定的研究，然而對于用堿液調(diào)節(jié)pH對丙酸桿菌發(fā)酵的影響還尚無報道。氨水相對于發(fā)酵上較常見的氫氧化鈉、碳酸鈣等調(diào)節(jié)pH有三方面的優(yōu)勢：一是氨水屬于弱堿，可以形成一個緩沖調(diào)節(jié)體系，二是在一定程度上可以提供氮源，三是不易形成沉淀。本文即主要研究補加氨水調(diào)節(jié)pH對丙酸桿菌分批發(fā)酵過程的影響，研究了在補加10%氨水調(diào)節(jié)不同pH的條件下丙酸桿菌的生長及代謝物的抑菌活性，為以后的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薛氏丙酸桿菌（Propionibacterium shermanii） 本實驗室分離并保存；惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida） 上海疾病控制防疫中心；惡臭假單胞菌培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基；氨水、苯酚、NaHSO3、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸、NaOH 均為分析純；丙酸桿菌種子培養(yǎng)基是SLB培養(yǎng)基[11]胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，60%乳酸鈉16.7m L，K2HPO40.25g，MnSO40.005g，加蒸餾水定容至1000m L，pH 7.0；丙酸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基是葡萄糖培養(yǎng)基 用2%的葡萄糖代替SLB中的乳酸鈉，其它成分不變。

TDL-5型高速離心機，96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，酶標(biāo)檢測儀（power wave xs）。

1.2 實驗方法

1.2.1 指示菌的制備 活化的惡臭假單胞菌按1.0%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37℃，200r/m in搖床振蕩培養(yǎng)過夜至OD600nm為0.2，再用無菌的LB培養(yǎng)基稀釋100倍備用。

1.2.2 丙酸桿菌的培養(yǎng)及其代謝物的制備 將丙酸桿菌接入種子培養(yǎng)基，32℃靜置培養(yǎng)48h作為種子液，按10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的150m L錐形瓶中，32℃靜置培養(yǎng)，每隔24h取樣一次。所取樣品于8000r/min冷凍離心15min取上清液，測定pH后用10%的NaOH溶液調(diào)pH至7.0，再用10%的酒石酸調(diào)至pH 5.3，最后進(jìn)行膜（0.22μm）過濾除菌，置于4℃冰箱中保存。

1.2.3 補加氨水方法 a.不同初始pH對丙酸桿菌發(fā)酵的影響 分別設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為6.5、7.0、7.5和8.0時進(jìn)行發(fā)酵，以確定丙酸桿菌代謝物最大抑菌活性的最佳初始pH。

b.補加氨水調(diào)節(jié)不同的pH 從第2d開始起間隔24h補加10%氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH分別為5.5、6.0和6.5，研究其對丙酸桿菌發(fā)酵及其代謝物抑菌活性的影響。以初始pH為7.0未補加氨水的發(fā)酵作為對照。

c.不同補加氨水時間對丙酸桿菌發(fā)酵的影響 選擇分別在發(fā)酵后的第2、3和4d開始間隔24h補加氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH6.0，研究不同補加時間對發(fā)酵的影響。

1.2.4 丙酸桿菌代謝物抑菌活性（AU）測定 采用改良的系列稀釋法[14]，測定丙酸桿菌代謝物抑菌活性，其中將丙酸桿菌代謝物用LB培養(yǎng)基（滅菌后用10%的酒石酸調(diào)pH 5.3）以2N逐步稀釋。制備酶標(biāo)板時每孔中加入20μL不同稀釋度的丙酸桿菌代謝物和180μL上述指示菌液，以空白的20μL LB培養(yǎng)基和180μL上述指示菌液做對照，每個稀釋度的樣品做三個平行，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h。抑菌活力的計算：在酶標(biāo)檢測儀上讀數(shù)測定每孔的OD600nm，OD值為對照值一半時代謝物的稀釋度為一個抑菌活性單位（AU）。

1.2.5 還原糖含量的測定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[15]。

1.2.6 生物量的測定 取丙酸桿菌發(fā)酵液50m L于8000r/m in離心15m in，沉淀用去離子水沖洗3次，105℃烘干至恒重后稱取質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始pH對丙酸桿菌發(fā)酵的影響

圖1 不同初始pH下發(fā)酵液的pH變化Fig.1 The pH value of the fermentation brothswith different initialmedium pH

各處理組發(fā)酵液的pH在第1、2d下降很快（圖1），pH均在第2d達(dá)到5左右，此后各處理組pH趨勢相同，表明不同初始pH對發(fā)酵后期的pH影響不大。

圖2 不同初始pH代謝物抑菌活性的變化Fig.2 Antimicrobial activity of themetaboliteswith different initialmedium pH

初始pH對代謝物抑菌活性有很大影響，如圖2顯示了不同初始pH發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸桿菌代謝物對惡臭假單胞菌的抑菌活性。初始pH 7.0、7.5和8.0時，抑菌活性均在第7d達(dá)到最大值，其中初始pH7.0時的抑菌活性最大，為7.59AU/m L，和其他實驗組差異顯著（p＜0.05）。因此，丙酸桿菌發(fā)酵的最優(yōu)初始pH為7.0。

2.2 補加氨水對丙酸桿菌發(fā)酵的影響

如圖3所示，補加10%氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH為6.0和6.5發(fā)酵所得的菌體生物量明顯增加，且生物量在第5d出現(xiàn)最大值，pH為6.0的實驗組為9.62mg/m L，極顯著高于對照組的（p＜0.01），但是和pH為6.5的實驗組差異不顯著。這一結(jié)果表明pH維持在6.0和6.5之間明顯有利于丙酸桿菌菌體生長。

圖3 補加10%氨水溶液調(diào)節(jié)不同pH時發(fā)酵液生物量的變化Fig.3 Biomass of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

根據(jù)圖4可以看出，補加10%氨水調(diào)節(jié)pH為6.0和6.5的實驗組還原糖消耗很快，在第5d分別僅有1.41和2.55mg/m L，和對照組差異極顯著（p＜0.01）。這與圖3的結(jié)果相吻合，表明菌體生長消耗了大量的還原糖。

圖4 補加10%氨水溶液調(diào)節(jié)不同pH時發(fā)酵液還原糖的變化Fig.4 Reducing sugar of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

如圖5所示，用10%氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液不同pH，丙酸桿菌代謝物的抑菌活性有明顯差異。實驗組最大抑菌活性值均出現(xiàn)在第5d，比對照組早兩天，且抑菌活性都明顯高于對照組。其中pH為6.0的實驗組在第5d達(dá)到最大值，為16.42AU/m L，抑菌活性與對照組的最大抑菌活性（發(fā)酵第7d）相比差異極顯著（p＜0.01），與其他實驗組相比也差異顯著（p＜0.05）。因此，用10%氨水溶液調(diào)節(jié)丙酸桿菌發(fā)酵液pH 6.0效果是發(fā)酵代謝物的最優(yōu)pH。

圖5 補加10%氨水溶液調(diào)節(jié)不同pH時代謝物抑菌活性的變化Fig.5 Antimicrobial activity of P.shermanii by feeding ammoniawater to adjust pH of broth

2.3 不同補加氨水時間對丙酸桿菌發(fā)酵的影響

由圖6可以看出，發(fā)酵第2d開始調(diào)節(jié)pH，生物量在第5d達(dá)到最大值，為9.55mg/m L，極顯著高于對照組最高值4.94mg/m L（發(fā)酵第6d，p＜0.01），其余實驗組與對照組則在發(fā)酵第6d達(dá)到生物量最大值。

圖6 不同時間補加氨水時發(fā)酵液生物量的變化Fig.6 Biomassof P.shermanii by feeding ammoniawater in different time

由圖7可以看出，發(fā)酵第2d用氨水調(diào)節(jié)pH的實驗組還原糖在第5d濃度已經(jīng)很低，為1.31mg/m L，其余各實驗組還原糖在第6d也基本利用完。這和圖6的生物量的實驗結(jié)果也比較相似。

圖7 不同時間補加氨水時還原糖的變化Fig.7 Reducing sugarby feedingammoniawater in different time

發(fā)酵第2d用氨水調(diào)節(jié)pH的實驗組抑菌活性最高，第5d的抑菌活性為16.47AU/m L，極顯著高于對照組和其他實驗組（p＜0.01）（圖8）。由此可見，從發(fā)酵第2d用氨水調(diào)節(jié)pH為6.0的發(fā)酵方式最好，不僅可以縮短發(fā)酵時間，還可以極顯著地提高抑菌活性。

圖8 不同時間下補加氨水時代謝物抑菌活性的變化Fig.8 Antimicrobialactivity of P.shermanii by feeding ammoniawater in different time

3 結(jié)論與討論

薛氏丙酸桿菌在初始pH為7.0時發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物抑菌活性最高，為7.59AU/m L，顯著高于其他實驗組；當(dāng)補加10%氨水調(diào)節(jié)pH為6.0時，薛氏丙酸桿菌的生物量和代謝物的抑菌活性都最大，分別為9.62mg/m L和16.42AU/m L；不同的氨水補加時間表明，從發(fā)酵第2d開始每隔24h調(diào)節(jié)pH為6.0時效果最好，生物量和代謝物的抑菌活性分別達(dá)到9.55mg/m L和16.47AU/m L，其中抑菌活性在第5d就達(dá)到了最大值，且極顯著高于對照組和其他實驗組的最大值（其他組第6d達(dá)到最大值，p＜0.01）。

由此可見，發(fā)酵第2d每隔24h補加10%氨水調(diào)節(jié)pH為6.0的發(fā)酵方式最好，不僅可以縮短發(fā)酵時間，還可以極顯著地提高抑菌活性。

目前進(jìn)行的丙酸桿菌發(fā)酵均是分批發(fā)酵，所以每次發(fā)酵在目標(biāo)產(chǎn)物開始出現(xiàn)并積累時，培養(yǎng)基中已經(jīng)積累了大量的生長限制因子和產(chǎn)物合成限制因子，如發(fā)酵產(chǎn)物乙酸、丙酸等有機酸，從而抑制了發(fā)酵液中菌體的生長和具有抑菌效價的丙酸桿菌代謝物的合成，為了增加發(fā)酵所得丙酸桿菌代謝物的抑菌效價，需要有效調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，本實驗首次用氨水對發(fā)酵液的pH進(jìn)行了調(diào)節(jié)，顯著提高了丙酸桿菌代謝物的抑菌活性，使其向工業(yè)化生產(chǎn)又邁進(jìn)了一步。

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Study on fermentation and metabolites antim icrobialactivity of Propionibacterium shermanii by feeding ammonia

WANG Xiao-yun1，JIN Feng-jie1，JIFen-fen2，CHANG Zhong-yi1，GAO Hong-liang1，*
（1.School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai200062，China；2.Shanghai Textile Research Institute，Shanghai200082，China）

The fed-batch culture p rocess and the antim icrobial activity ofmetabolites from Propionibacterium. shermanii against Pseudomonas.putida by feed ing ammonia water were studied.The results showed that the activity ofmetabolites was 7.59AU/m L，when the initialmedium was pH 7.0，and the antim icrobial activity was remarkab le higher than that of other g roups（p＜0.05）.When feeding 10%ammonia water to ad just pH of broth to 6.0，the biomass of P.shermanii was 9.62mg/m L，and the antim icrobialactivity ofmetabolites was 16.42AU/m L. both of them were the highest among all the treatments.The pH of broth was ad just to 6.0 w ith 10%ammonia water begin w ith 2，3 and 4d，respectively.Maximalmetabolites antim ic robialactivity（16.47AU/m L）and maximal biomass（9.55mg/m L）were observed，when ad just pH w ith 10%ammonia water begin w ith 2d.It could remarkab ly im p rove the antim icrobial activity ofmetabolites from P.Shermanii against P.putida when feed ing 10%ammonia water to ad just pH of b roth in the batch-culture.

Prop ionibacterium Shermanii；ammonia water；antim icrobialactivity

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0224-04

2011－11－17 *通訊聯(lián)系人

王曉云（1987-），女，在讀碩士，研究方向：食品微生物。

上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室開放基金項目（Shagb2009-02）。