王成忠，高 超，趙乃峰

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.山東廣明實(shí)業(yè)有限公司，山東濱州 250210）

復(fù)合酶結(jié)合堿法制備麥胚多肽的研究

王成忠1，高 超1，趙乃峰2

（1.山東輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250353；2.山東廣明實(shí)業(yè)有限公司，山東濱州 250210）

研究了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合水解麥胚蛋白的最佳工藝，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：酶解的最佳pH為6，底物濃度為5%，溫度為50℃，水解時(shí)間為120min，加酶量為400U/g，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的添加量的配比（活性比）為1∶1，多肽的提取率達(dá)到最高為89.87%。并且，本文將酶法和堿提方法相結(jié)合，調(diào)節(jié)pH 8.5左右，45℃堿提1h，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。本工藝與傳統(tǒng)工藝相比，酶用量減少了，小麥胚芽多肽的提取率提高了，因此降低了生產(chǎn)成本。

蛋白酶，麥胚，多肽，堿提

小麥胚芽中蛋白質(zhì)即小麥胚芽蛋白質(zhì)（Wheat Germ Proein，WGP）含量高達(dá)30%左右[1]，其中清蛋白占30.2%，球蛋白占18.9%，麥醇溶蛋白占14.0%，麥谷蛋白占0.3%～0.37%，水不溶性蛋白占30.2%[2]。WGP是一種完全蛋白，它含有人體必需的8種氨基酸和2種半必需氨基酸，占總氨基酸34.74%[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽蛋白中含有谷胱甘肽，具有清除自由基的作用。小麥蛋白生產(chǎn)制備的ACE抑制肽活性高、含量多，被認(rèn)為是開發(fā)ACE抑制活性肽最具潛力的食物蛋白源。同時(shí)，麥胚蛋白多肽中還含有阿片活性肽，其主要功能有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛；保護(hù)心血管、心??；增強(qiáng)免疫力；調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)；增強(qiáng)記憶力；調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、精神情緒和調(diào)整睡眠等作用[5-6]。本文利用兩種酶復(fù)合降解小麥胚芽蛋白，使麥胚蛋白變成可溶的肽類而被分離出來[7]，并結(jié)合了堿提的方法提高其提取率。以往的研究中只選用單一酶，提取率不高且酶用量大。根據(jù)不同酶的酶切位點(diǎn)不同，兩種酶的混合使用使蛋白質(zhì)水解得更好，提取率更高，也節(jié)省了酶的使用量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂后的小麥胚芽 山東廣明實(shí)業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為80萬U/g）/中性蛋白酶（酶活力為20萬U/g） 山東省發(fā)酵設(shè)計(jì)院。

RE-6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH.SY21-Ni型恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；YP3001N型電子天平、ALC-210A型分析天平、722S分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；BCD-247E1型電冰箱 伊萊克斯公司。

1.2 工藝流程[7-10]

脫脂后的小麥胚芽→粉碎→加酶水解→利用食品級氫氧化鈉調(diào)pH至8.5左右，45℃堿提1h→滅酶→冷卻→離心→酶解液→多肽含量的測定

1.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝實(shí)驗(yàn)

取下列五個(gè)因子進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)：提取溫度（A），底物濃度（B），提取時(shí)間（C），pH（D），加酶量（E），每個(gè)因子取四個(gè)水平，具體的安排見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment table

1.4 多肽提取率的測定

采用離心的方法，收集上清液，得到麥胚水解液。取1m L定容至100m L，用Folin-酚法測定其多肽含量，根據(jù)以下公式得到提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

從木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶四種蛋白酶中選出兩種酶對脫脂后的小麥胚芽蛋白進(jìn)行水解。

分別取20g脫脂麥胚（過60目篩，蛋白質(zhì)含量36.5%左右）于四個(gè)250m L燒杯中，按照每種蛋白酶的最適反應(yīng)條件（見表2）水解蛋白，離心后得到水解液，用Folin-酚法測水解液中多肽的含量，得出其提取率。其結(jié)果如圖1。

表2 不同的蛋白酶的作用條件Table 2 The conditions of different proteases

圖1 不同種蛋白酶與麥胚多肽的提取率的關(guān)系Fig.1 Relationship of different types of proteases and extraction rate ofwheatgerm peptides

由圖1可知，提取率由高到低分別為堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，中性蛋白酶。因此，理論上要得到較高的提取率可以選擇堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶。但是，經(jīng)過品嘗后，堿性蛋白酶水解得到的水解液略有苦味，因此舍棄堿性蛋白酶，選擇木瓜蛋白酶。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶提取率分別為53.84%和50.55%，相差不大。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，中性蛋白酶的添加量為500U/g底物較菠蘿蛋白酶添加量607U/g底物少，且由于中性蛋白酶是微生物發(fā)酵產(chǎn)生的，較菠蘿蛋白酶價(jià)格便宜，同時(shí)中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)條件也很相近，因此，本次實(shí)驗(yàn)選用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶兩種酶復(fù)合進(jìn)行小麥胚芽多肽的制備。

2.2 最佳復(fù)合酶配比的選擇

通過以上實(shí)驗(yàn)，我們選擇了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。初定酶用量為500U/g，取其酶活比1∶3、1∶2、1∶1和2∶1的比例配比混合，在55℃，pH為6，底物濃度為6%的條件下水解2小時(shí)，測其水解液中多肽的含量，得出提取率，結(jié)果如圖2。

圖2 復(fù)合酶配比與麥胚多肽提取率的關(guān)系Fig.2 Relationship of enzyme ratio and extraction rate of wheat germ peptides

由圖2可知，當(dāng)木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的比例為1∶1時(shí)，其提取率最大。隨著中性蛋白酶酶量的增加，提取率有所下降，可能是由于在水解麥胚蛋白時(shí)，木瓜蛋白酶起到主導(dǎo)作用，而中性蛋白酶的添加促進(jìn)了木瓜蛋白酶的作用，因此將木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的配比定為1∶1。

2.3 最佳提取溫度的選擇

取20g過60目的脫脂麥胚5份于燒杯中，在加酶量為500U/g，木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶活力比為1∶1，pH為6，底物濃度為6%，溫度分別為40、45、50、55、60℃條件下水解2h后比較多肽的提取率，結(jié)果如圖3。

圖3 溫度與麥胚多肽提取率的關(guān)系Fig.3 Relationship of temperature and extraction rate of wheat germ peptides

由圖3可知，溫度的升高，增加了酶促反應(yīng)速度，使提取率逐漸增大，但當(dāng)溫度升高至50℃以后，由于蛋白酶的穩(wěn)定性降低，酶活也隨之下降，因此提取率也逐漸降低。將實(shí)驗(yàn)的最適反應(yīng)溫度定為50℃。

2.4 最佳提取pH的選擇

取20g脫脂麥胚5份于燒杯中，在50℃，pH分別為4、5、6、7、8的條件下水解2h，加酶量和底物濃度同上。通過Folin-酚法測得的多肽提取率的結(jié)果如圖4。

圖4 pH與麥胚多肽提取率的關(guān)系Fig.4 Relationship of pH and extraction rate of wheat germ peptides

從圖4可看出，隨著pH的升高，兩種蛋白酶的活性增強(qiáng)，使麥胚多肽提取率逐漸升高，當(dāng)pH為6和7時(shí)提取率較高，且相差并不大，說明這兩種酶復(fù)合在一起時(shí)最適pH在6~7之間。隨著pH的繼續(xù)增大，使蛋白酶的活性受到抑制，提取率卻隨之減小。因此，將實(shí)驗(yàn)的最佳pH確定為6~7之間。

2.5 最佳提取時(shí)間的選擇

分別取20g脫脂麥胚5份于燒杯中，在50℃，pH為6，底物濃度為6%，加酶量同上的條件下水解30、60、90、120和150m in測定多肽提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 時(shí)間與麥胚多肽提取率的關(guān)系Fig.5 Relationship of time and extraction rate of wheat germ peptides

從圖5可以看出，提取的多肽量從開始的30min起呈明顯的上升趨勢，但到90m in基本達(dá)到穩(wěn)定，說明90m in之前蛋白酶起到了顯著的作用，酶解90m in以后，延長提取時(shí)間是無效的，并且酶解時(shí)間過長容易造成微生物的污染。因此，將實(shí)驗(yàn)的最佳提取時(shí)間定為90m in。

2.6 最佳底物濃度的選擇

分別取20g脫脂麥胚5份于燒杯中，在50℃，pH為6，底物濃度分別為9%、7%、5%和3%，加酶量同上的條件下水解90m in測定多肽提取率，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨著底物濃度的降低提取率逐漸升高，但這一條件不僅影響到多肽的提取率，同時(shí)也要考慮生產(chǎn)成本的合理性。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，將最佳的底物濃度定為5%。

圖6 底物濃度對麥胚多肽提取率的影響Fig.6 Relationship of substrate concentration and extraction rate ofwheatgerm peptides

2.7 最佳添酶量的選擇

分別取20g脫脂麥胚5份于燒杯中，在50℃，pH為6，底物濃度為5%，加酶量分別為200、300、400、500和600U/g，水解90m in后，測定多肽提取率其結(jié)果見圖7。

圖7 添酶量對麥胚多肽提取率的影響Fig.7 Relationship of the quantity of enzyme activity and extraction rate ofwheatgerm peptides

從圖7可以看出，隨著加酶量的增加，提取率趨于直線增加，但當(dāng)加酶量增加到400U/g后基本趨于平穩(wěn)，因此最佳添酶量為400U/g。

2.8 最佳酶解條件的確定

取提取溫度（A），底物濃度（B），提取時(shí)間（C），pH（D），加酶量（E）五個(gè)因子進(jìn)行條件實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因子取四個(gè)水平，選用L16（45）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，詳見表3。

通過表2分析可看出，各因素對提取率影響大小為B＞C＞A＞D＞E，即底物濃度對提取率有很大的影響，是關(guān)鍵控制因素，其次為提取時(shí)間。同時(shí)可確定最佳配方為A2B4C4D1E3，即提取溫度為50℃，底物濃度為5%，時(shí)間為120m in，pH為6，加酶量為400U/g。

2.9 空白、驗(yàn)證及堿提實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照上面正交實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并做一個(gè)與其水解條件相同但不添加蛋白酶的空白實(shí)驗(yàn)作對照。在驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上將酶解液的pH調(diào)節(jié)為8.5左右，45℃堿提1h后滅酶，離心得到酶解液，測其多肽提取率。得到的結(jié)果如表4。

上述結(jié)果表明，利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合水解麥胚使麥胚多肽的提取率提高了60.22%，同時(shí)將酶法和堿提方法相結(jié)合，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。

3 結(jié)論

3.1 在木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的添加量的配比（活性比）為1∶1的條件下，通過正交實(shí)驗(yàn)確定了木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合水解麥胚蛋白的最佳工藝為：pH為6，底物濃度為5%，溫度為50℃，提取時(shí)間為120m in，加酶量為400U/g，麥胚多肽的提取率高達(dá)89.87%。

3.2 通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到：利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合水解麥胚蛋白使麥胚多肽的提取率與空白實(shí)驗(yàn)相比提高了60.22%，同時(shí)將酶法和堿提方法相結(jié)合，使多肽的提取率由89.87%提高到93.76%。本工藝與傳統(tǒng)工藝相比，酶用量減少了，小麥胚芽多肽的提取率得到了提高，降低了生產(chǎn)成本。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析表Table 3 Orthogonal test results and data analysis table

表4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表Table 4 Test data analysis table

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Study on preparation ofwheat germ peptides w ith multip lex enzymes and Alkali

WANG Cheng-zhong1，GAO Chao1，ZHAO Nai-feng2
（1.Departmentof Food and Biology Engineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China；2.Shandong Guang Ming Industrial Co.，Ltd.，Binzhou 250210，China）

The op timum enzymatic p rocess ofwheatgerm p roteins was studied in ourpaper，which was hyd rolyzed by the m ixture of papain and neutral p rotease.The op timum cond itions were investigated by orthogonal test. The results showed thatwhen ratio of papain to neutral p rotease was set as 1∶1，the maximum rate of pep tides extraction was up to 89.87%under the cond ition of pH6，substrate concentration 5%，temperature 50℃，time 120m in and consumed enzyme 400U/g.In addition，enzymatic and alkaline extraction methods were combined in this paper.The cond ition for extraction was pH 8.5，45℃，alkaline extracting for 60m in.Itwas p roved that the extracting ratio of wheat germ pep tides was increased from 89.87%to 93.76%.Compared with the trad itional p rocess，the enzyme consum p tion was decreased，and the rate ofwheatgerm pep tides extrac tion was increased，thus the p roduction costwas saved.

p rotease；wheatgerm；pep tides；Alkali

TS201.2

A

1002-0306（2012）14-0210-04

2011－10－25

王成忠（1964-），男，教授，研究方向：食品資源開發(fā)。