王詩路，劉 輝，咸 漠，*

（1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

響應(yīng)面優(yōu)化酶催化米糠油甘油解制備甘油二酯

王詩路1，2，劉 輝1，咸 漠1，*

（1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101；2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049）

利用響應(yīng)面（RSM）對叔丁醇溶劑體系中的脂肪酶Novozym 435催化米糠油甘油解反應(yīng)合成甘油二酯（DAG）的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素實驗基礎(chǔ)上選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、酶添加量（酶和米糠油質(zhì)量比）、底物質(zhì)量比（米糠油∶甘油）等4個因素作為自變量，以DAG的產(chǎn)率為響應(yīng)值，進(jìn)行5水平4因素中心組合旋轉(zhuǎn)設(shè)計（CCRD）優(yōu)化，確定了影響DAG合成的關(guān)鍵因素以及最佳反應(yīng)條件。分析結(jié)果表明，在各影響因素中，底物質(zhì)量比對DAG的產(chǎn)率影響最大。綜合考慮優(yōu)化和節(jié)約后，利用模型計算DAG合成的最佳條件：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間10.5h，加酶量10.66%，底物質(zhì)量比16，在此條件下DAG產(chǎn)率是53.08%。

響應(yīng)面，甘油二酯，米糠油，甘油解

甘油二酯（diacylglycerol，DAG）是天然油脂的組分之一。DAG包括兩種同分異構(gòu)體，分別是sn-1，3-DAG和sn-1，2（2，3）-DAG，它們在天然產(chǎn)物中的比例約為7∶3[1]。DAG的能量值和可消化性與甘油三酯相近[2]。近年來大量實驗表明，與傳統(tǒng)的甘油三酯相比較，DAG具有降體脂、降血脂、抑制體重增加等功能[3-5]，因此是一種更利于身體健康的食用油料。1999年，日本花王公司將DAG含量為80%的新型食用油投入市場；2005年，該產(chǎn)品又成功進(jìn)入全美市場進(jìn)行銷售[6]。目前，國內(nèi)DAG尚處于研發(fā)階段，市場上還沒有相關(guān)產(chǎn)品[7]。米糠油是一種營養(yǎng)豐富的植物油，食后吸收率達(dá)90%以上[8]。米糠油與其他食用油相比，具有降膽固醇、降血壓、加速血液循環(huán)、刺激體內(nèi)激素分泌、促進(jìn)人體發(fā)育等作用，是有益于人體健康的保健油，有的還將其美譽(yù)為“青春油”[9]。此外，我國的稻谷年產(chǎn)量在1.9億t左右，年產(chǎn)米糠約1000萬t；如果一半用于制油，可年產(chǎn)食用精煉米糠油60萬t左右，生產(chǎn)潛力巨大[10]。因此，利用米糠油作為原料制備DAG，不但可以滿足對于原料營養(yǎng)成分的要求，而且由于原料來源豐富，可以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本研究是選用固定化脂肪酶Novozym 435，在叔丁醇溶劑體系中催化米糠油和甘油通過甘油解反應(yīng)合成DAG。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、加酶量、底物質(zhì)量比（米糠油∶甘油）4個因素對DAG產(chǎn)率的影響，探索DAG合成的最佳條件，對脂肪酶催化的米糠油甘油解制備DAG的條件進(jìn)行優(yōu)化，為提高合成DAG產(chǎn)量和效率提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠油 遼寧中稻股份有限公司；Novozym 435（酶活10000PLU/g，注：在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1μmol的丙基月桂酸脂所需的酶量為一個單位，用PLU表示） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；三油酸甘油酯、1，2-二棕櫚酸甘油酯、1，3-二油酸甘油酯、單油酸甘油酯 Sigma-A ldrich中國公司，色譜標(biāo)準(zhǔn)品；甘油、叔丁醇、正己烷、異丙醇、乙醚和甲酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

BT-224S電子分析天平 德國Sartorius公司；Sigma 1-14型離心機(jī) 德國SIGMA公司；HZS-HA恒溫水浴振蕩器 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IATROSCAN MK-6S棒狀薄層色譜-火焰離子檢測分析儀（TLC/FID） 日本三菱雅特隆公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘油解反應(yīng) 精確稱取6g米糠油和一定質(zhì)量比的甘油置于帶塞的100m L錐形瓶中，然后加入一定量的固定化脂肪酶（Novozym 435），再加入6g叔丁醇，并放入一定的溫度、轉(zhuǎn)速為150r/m in的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)，一定時間后取出20μL樣品，用1m L正己烷∶異丙醇（v∶v，10∶1）溶解后，離心除去固定化酶，濾液低溫靜置保存待分析。

1.2.2 TLC/FID測定DAG含量 將色譜棒放人掃描架中，掃描儀的掃描模式設(shè)置為空白掃描模式。之后，將色譜棒架置于點樣板上，用微量分配器取樣1μL，點在各色譜棒的零點位置。色譜棒架放入展層缸，展層液組分為正己烷∶乙醚∶甲酸=42∶28∶0.3（v∶v∶v）。當(dāng)溶劑前沿到達(dá)100mm處時，取出色譜棒放入干燥器（120℃下干燥2~3m in）。展開劑完全被清除后，放入掃描架中進(jìn)行掃描（氫氣流量160m L/m in，空氣流量2L/min，掃描速率：0.5min/s）。依據(jù)三油酸甘油酯（TAG）、1，2-二棕櫚酸甘油酯（1，2-DAG）、1，3-二油酸甘油酯（1，3-DAG）和單油酸甘油酯（MAG）標(biāo)準(zhǔn)品的保留位置來確定樣品中的甘油酯類別。分別以各自的峰面積為縱坐標(biāo)Y，濃度為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程：YTAG=8368.6XTAG，R2=0.9937；Y1，2-DAG=7777.3X1，2-DAG，R2=0.9943；Y1，3-DAG=8983.5X1，3-DAG，R2=0.9839；YMAG=6402.3XMAG，R2=0.9985。

DAG產(chǎn)率計算公式如下：

1.2.3 單因素實驗 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇反應(yīng)溫度（℃）、反應(yīng)時間（h）、加酶量（酶與米糠油質(zhì)量比，%）、底物質(zhì)量比（米糠油與甘油質(zhì)量比）這4個因素進(jìn)行單因素實驗，分別考察其對DAG產(chǎn)率的影響，確定各因素的優(yōu)化區(qū)間。反應(yīng)步驟見甘油解反應(yīng)，選擇反應(yīng)溫度為40、50、60、70℃；反應(yīng)時間為4、6、8、12h；加酶量為2%、4%、8%、12%、16%；底物質(zhì)量比為5、10、15、20、25。每組實驗做3個平行樣，取其平均值。

1.2.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計和分析 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，本實驗依據(jù)RSM中的CCRD原理，采用Design-Expert 8軟件設(shè)計并分析4因素5水平共30組獨立隨機(jī)實驗。實驗選取反應(yīng)溫度（℃）、反應(yīng)時間（h）、加酶量（酶與米糠油質(zhì)量比，%）、底物質(zhì)量比（米糠油與甘油質(zhì)量比）這4個因素，以產(chǎn)物中DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）為響應(yīng)值Y。每組實驗做3個平行樣，取其平均值。實驗因素水平編碼設(shè)計見表1。

表1 實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 模型的驗證 通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化Novozym 435催化米糠油甘油解制備DAG反應(yīng)。在優(yōu)化的反應(yīng)條件下檢測DAG產(chǎn)率，通過比較預(yù)測值和實驗值來驗證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)溫度對DAG產(chǎn)率的影響 反應(yīng)溫度對DAG產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 反應(yīng)溫度對DAG產(chǎn)率的影響Fig.1 Influence of reaction temperature on DAG yield

由圖1可知，反應(yīng)溫度從40℃升至50℃，DAG產(chǎn)率上升；從50℃升至60℃，DAG產(chǎn)率呈下降趨勢。之后，從60℃升至70℃，DAG產(chǎn)率再次上升。在其它條件不變的情況下，單因素實驗結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度在40℃時DAG產(chǎn)率低于50%，在50~70℃區(qū)間均高于50%，說明反應(yīng)適宜溫度范圍為50~70℃。

2.1.2 反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響 反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時間對DAG產(chǎn)率的影響Fig.2 Influence of reaction time on DAG yield

由圖2可知，反應(yīng)時間從4h到6h，DAG產(chǎn)率略有下降；從6h到12h，DAG產(chǎn)率逐漸上升。在其它條件不變的情況下，單因素實驗結(jié)果顯示，反應(yīng)時間在4h至12h之間，DAG產(chǎn)率波動范圍為0.45%，說明在此時間段內(nèi)反應(yīng)時間對于DAG產(chǎn)率的影響較小。

2.1.3 加酶量對DAG產(chǎn)率的影響 加酶量對DAG產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對DAG產(chǎn)率的影響Fig.3 Influence of enzyme amounton DAG yield

由圖3可知，加酶量從2%增加到8%，DAG產(chǎn)率升高；從8%增加到16%，DAG產(chǎn)率下降。在其它條件不變的情況下，單因素實驗結(jié)果顯示，反應(yīng)適宜加酶量在4%~12%之間。

2.1.4 底物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響 底物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 底物質(zhì)量比對DAG產(chǎn)率的影響Fig.4 Influence of substratemass ratio on DAG yield

由圖4可知，底物質(zhì)量比從5增加到15，DAG產(chǎn)率顯著上升；從15增加到25，DAG產(chǎn)率顯著下降。在其它條件不變的情況下，單因素實驗結(jié)果顯示，底物質(zhì)量比在5至25之間，DAG產(chǎn)率波動范圍為17.5%，說明底物質(zhì)量比對于DAG產(chǎn)率的影響顯著。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

2.2.1 方差分析 根據(jù)表1中的實驗因素與水平的設(shè)計進(jìn)行了30組實驗，實驗結(jié)果見表2。對表2的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

采用Design Expert軟件，對表2中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

回歸模型方差分析見表3。結(jié)果表明：模型p＜0.0001，模型達(dá)到極顯著水平，且失擬項p=0.1108＞0.05，失擬不顯著。此外，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9075，校正系數(shù)R2Adj=0.8212，表明模型能解釋82.12%響應(yīng)值的變化。以上分析表明該模型變量與自變量之間的模型關(guān)系顯著，擬合程度比較好，實驗誤差小，可以用此模型對DAG產(chǎn)率進(jìn)行分析和預(yù)測。

根據(jù)回歸系數(shù)估計值可知，各因素貢獻(xiàn)率為：D＞C＞B＞A，即底物質(zhì)量比＞加酶量＞反應(yīng)時間＞反應(yīng)溫度。模型中的一次項C、D和二次項D2極顯著，二次項AC顯著。說明底物質(zhì)量比和加酶量這兩個因素對于DAG產(chǎn)率主效應(yīng)明顯，反應(yīng)溫度和加酶量對DAG產(chǎn)率有交互作用的影響。

2.2.2 響應(yīng)面分析 通過對模型響應(yīng)面以及相對應(yīng)的等高線進(jìn)行分析，并對模型進(jìn)行優(yōu)化，從而得到脂肪酶Novozym 435催化米糠油甘油解生成DAG的最佳反應(yīng)條件。模型的響應(yīng)面及其等高線見圖5。

圖5 響應(yīng)面及其等高線圖Fig.5 Response surface plotand contour plot

由圖5可知，除加酶量和反應(yīng)溫度存在顯著的交互作用外，其他的兩因素之間均無顯著交互作用。加酶量和反應(yīng)溫度之間的關(guān)系是：在其他條件固定，當(dāng)要得到相同的DAG產(chǎn)率時，升高反應(yīng)溫度，則所需的酶量減少；增加加酶量，則所需的反應(yīng)溫度降低。此外，在底物質(zhì)量比和其他3個因素的交互作用中，底物質(zhì)量比均是影響DAG產(chǎn)率的主要因素，由此可以推導(dǎo)出底物質(zhì)量比是4個因素中是影響DAG產(chǎn)率的最主要因素。

2.3 模型優(yōu)化與驗證

Novozym 435是可以多次重復(fù)使用的固定化酶，雖然可以在70℃及以上溫度維持酶活，但是適宜的反應(yīng)溫度范圍是40~60℃，高溫會加速酶的熱失活，降低使用壽命，增加平均成本并且浪費能源[11]。為兼顧優(yōu)化和節(jié)約，將反應(yīng)溫度設(shè)定為50~60℃，再利用Design Expert軟件分析，得出最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間10.5h，加酶量10.66%，底物質(zhì)量比16，此時DAG產(chǎn)率預(yù)測值為52.84%。在此條件下進(jìn)行三次實驗，平均值為53.08%，高于模型預(yù)測值0.45%，與預(yù)測值無顯著差異。說明采用響應(yīng)面優(yōu)化得到的DAG產(chǎn)率數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，具有實用價值。此外，張超等[12]利用Novozym 435催化紫蘇籽油生成DAG的研究的最佳條件是：反應(yīng)溫度75℃，反應(yīng)時間14.5h，加酶量11.8%，底物摩爾比（甘油∶紫蘇籽油）=1∶1.5，此條件下得到的DAG含量的理論值為52.67%，實際值為54.33%。由此可見，盡管最優(yōu)條件并不相同，但是Novozym 435催化這兩種油脂發(fā)生甘油解反應(yīng)具有相近的反應(yīng)極值。

3 結(jié)論

利用Design Expert軟件，在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化Novozym 435催化米糠油甘油解的實驗條件，并且兼顧優(yōu)化和節(jié)約的原則，得到DAG的最佳生產(chǎn)條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間10.5h，加酶量10.66%，底物質(zhì)量比16。在此條件下，DAG產(chǎn)率平均值是53.08%，與預(yù)測值無顯著差異。

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Optim ization of diacylglycerolproduction from lipase-catalyzed glycerolysis of rice bran oilby response surface methodology

WANG Shi-lu1，2，LIU Hui1，XIAN M o1，*
（1.Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China）

Response surface methodology（RSM）was app lied to op tim ize the d iacylg lycerol（DAG）p roduction from Novozym 435-catalyzed g lycerolysis of rice b ran oil in t-Butanolsystem.Based on sing le-factor analysis，5-level-4-factor central com posite rotatab le design（CCRD）was emp loyed to evaluate and op tim ize the effect of DAG synthesis parameters，such as reaction tem perature，time，enzyme amount（mass ratio of lipase to rice b ran oil），and substrate mass ratio（rice b ran oil∶g lycerol）.The results ind icated that substrate mass ratio was the most im portant variab le.Considering the econom ical efficiency as well as op tim ization，the op timum DAG synthesis conditions w ith the yield of 53.08%were as follows：reaction tem perature 60℃，time 10.5h，enzyme amount10.66%，substrate mass ratio 16.

RSM；DAG；rice b ran oil；g lycerolysis

TS221

A

1002-0306（2012）14-0192-04

2011－10－13 *通訊聯(lián)系人

王詩路（1984-），女，博士研究生，研究方向：生物合成與生物轉(zhuǎn)化。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21106170）。