張紅發(fā)，任 婧，劉 景，游春蘋，顧瑾麟

（1.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

酸奶中長(zhǎng)雙歧桿菌PCR計(jì)數(shù)方法的建立

張紅發(fā)1，2，任 婧1，劉 景1，游春蘋1，顧瑾麟1

（1.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200436；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

根據(jù)細(xì)菌保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，作為陽(yáng)性標(biāo)記；根據(jù)長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區(qū)基因序列設(shè)計(jì)定性PCR引物。用BBL瓊脂平板對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌混合發(fā)酵的酸奶進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，隨機(jī)挑選部分長(zhǎng)出的菌落，提取DNA做PCR鑒定。將PCR技術(shù)與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)技術(shù)結(jié)合起來，初步建立酸奶中長(zhǎng)雙歧桿活菌計(jì)數(shù)方法。抽提方法操作簡(jiǎn)便、高效、靈敏，決定著PCR計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確高效，本研究著重研究了菌體DNA抽提方法的影響因素，以及抽提方法通用性，同時(shí)也研究了PCR引物的特異性。將PCR技術(shù)與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)技術(shù)結(jié)合起來，初步建立酸奶中長(zhǎng)雙歧桿活菌計(jì)數(shù)方法。

PCR，計(jì)數(shù)，長(zhǎng)雙歧桿菌

雙歧桿菌為存在人類腸道中益生菌，近年來國(guó)內(nèi)外含雙歧桿菌活菌混和制劑日益增多特別是含雙歧桿菌和乳酸菌混合發(fā)酵的奶類制品[1]。產(chǎn)品中活菌數(shù)決定著產(chǎn)品質(zhì)量，準(zhǔn)確、快速的雙歧桿菌活菌計(jì)數(shù)方法越來越重要。而GB/T4789-34-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)》中對(duì)雙歧桿菌采用生化反應(yīng)和酶活測(cè)定鑒定，操作復(fù)雜，周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，實(shí)際操作困難。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)與鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)和生理特征，需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和一系列生化反應(yīng)檢測(cè)，方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)[2]；而PCR技術(shù)具有高度的特異性和敏感性[3]，打開了細(xì)菌快速鑒定的大門[4]。其不僅操作簡(jiǎn)便、快速可靠并且靈敏、高效，還克服了對(duì)培養(yǎng)的依賴性[5]。隨著基因技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)的發(fā)展，一般細(xì)菌的基因序列在網(wǎng)上都可以免費(fèi)方便地查到；國(guó)內(nèi)微生物基因測(cè)序公司也有很多，測(cè)序結(jié)果也很準(zhǔn)確、方便、便宜，設(shè)計(jì)微生物種、屬甚至菌株特異性PCR引物變得容易、經(jīng)濟(jì)。但PCR難以區(qū)分樣品中微生物的死活，計(jì)數(shù)樣品中的活菌需要與傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法相結(jié)合。為了初步建立酸奶中長(zhǎng)雙歧桿菌PCR計(jì)數(shù)方法，研究了菌體DNA抽提方法的影響因素，以及抽提方法通用性。加熱煮沸法操作簡(jiǎn)單，可以破壞G+細(xì)胞壁，使基因組DNA釋放出來，雖然有部分DNA可能被破壞降解，但仍能夠滿足PCR要求[6]。培養(yǎng)基也含有污染微生物的核酸[7]，若抽提方法過于靈敏，難以排除污染干擾。抽提方法要求操作簡(jiǎn)便、高效，同時(shí)可以克服培養(yǎng)基中污染基因物質(zhì)干擾。根據(jù)長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區(qū)基因序列設(shè)計(jì)定性PCR引物，研究了引物的特異性。結(jié)合具體實(shí)例，用BBL瓊脂平板對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌混合發(fā)酵的酸奶進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，再PCR計(jì)數(shù)鑒定，最后計(jì)算出長(zhǎng)雙歧桿菌活菌數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacteriumanimalis）、 兩 岐 雙 岐 桿 菌（Bifidobacterium bifidum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 丹麥Dansico提供；長(zhǎng)雙歧桿菌BL-1（Bifidobacterium longum） 光明乳業(yè)技術(shù)中心篩選并保藏；生鮮乳 采自上海第九牧場(chǎng)；BBL瓊脂培養(yǎng)基 上海滬峰生化試劑有限公司；半胱氨酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Taq DNA聚合酶、W ide Range DNA Marker TaKaRa公司。

Bugbox厭氧培養(yǎng)箱 英國(guó)Ruskinn Technology Limited公司；Veriti Thermal Cycler 96-well PCR儀美國(guó)App lied Biosystems公司；Type A2/Class II生物安全柜 美國(guó)Labconco公司；5424R小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)eppendorf公司；Leica DM 4000M顯微鏡

德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體DNA提取效果檢驗(yàn)PCR 選取培養(yǎng)平板上的單菌落，用10μL滅菌槍頭吸取菌體1μL，懸浮于20μL提取液（20mmol/L Tris/HCl，pH8.3）中。在研究菌體吸取量對(duì)PCR影響時(shí)，用去離子水做梯度稀釋。抽提方法采取煮沸法，具體操作參考文獻(xiàn)[8-9]。煮沸后的混合物直接作為PCR模板，用細(xì)菌16S rRNA通用引物：上游引物325F（5’-TCC TAC GGG AGG CAG CA-3’）和下游引物1367R（5’-CGG GCG GTG TGT ACA A-3’），做PCR，檢驗(yàn)抽提效果。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1000bp左右，所采用的PCR擴(kuò)增條件都為：95℃預(yù)熱5m in，30個(gè)循環(huán)（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5m in。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR鑒定計(jì)數(shù)

1.2.2.1 長(zhǎng)雙歧桿菌平板計(jì)數(shù) 長(zhǎng)雙歧桿菌酸奶由滅菌牛奶經(jīng)嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）混合發(fā)酵而成。發(fā)酵好的長(zhǎng)雙歧桿菌酸奶，參照國(guó)標(biāo)GB/T 4789-34-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)》做法，系列稀釋，選擇合適的稀釋倍數(shù)，倒BBL瓊脂平板，厭氧培養(yǎng)計(jì)數(shù)。選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平皿和稀釋度計(jì)數(shù)，平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得到樣品菌落總數(shù)[10]。

1.2.2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR鑒定 細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)記PCR引物是16S rRNA的通用引物[11-12]：上游引物16F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物16R（5’-C TGC TGC CTC CCG TAG GAG-3’）。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為300bp左右。

對(duì)發(fā)酵的長(zhǎng)雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區(qū)基因序列進(jìn)行測(cè)序，具體操作參照文獻(xiàn)[10]。NCBI網(wǎng)上比對(duì)分析，設(shè)計(jì)長(zhǎng)雙歧桿菌定性PCR引物，上游引物B-F（5’-CCA TCA TCC GCT TTC G-3’），下游引物B-R（5’-TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3’），PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為215bp。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)液組成（總體積30μL）：上游引物（5μmol/L）3μL，下游引物（5μmol/L）3μL，2.5mmol/L dNTP 2.4μL，10×PCR Buffer 3μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1U，加去離子水至30μL。

所采用的PCR擴(kuò)增條件都為：95℃預(yù)熱5m in，30個(gè)循環(huán)（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

長(zhǎng)雙歧桿菌發(fā)酵酸奶培養(yǎng)計(jì)數(shù)后，找出菌落數(shù)在30~300之間的平板，挑選一定數(shù)量的單菌落，標(biāo)記編號(hào)，用滅菌槍頭吸取菌體；在平板空白處吸取培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照監(jiān)測(cè)PCR污染。提取菌體DNA，做PCR鑒定。根據(jù)PCR鑒定為陽(yáng)性的長(zhǎng)雙歧桿菌所占的比例，以及平板計(jì)數(shù)的菌落總數(shù)計(jì)算出目標(biāo)細(xì)菌的數(shù)量。

1.2.3 鏡檢驗(yàn)證 用10μL滅菌槍頭吸取對(duì)應(yīng)編號(hào)菌體，懸浮于20μL無菌水，涂片。結(jié)晶紫簡(jiǎn)單染色，鏡檢觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 抽提方法

2.1.1 菌體吸取量對(duì)PCR的影響 由于平板上長(zhǎng)出的菌落大小、位置不定，吸取菌體量有波動(dòng)，是否對(duì)PCR有影響必須研究。吸取長(zhǎng)雙歧桿菌劃線平板單菌落，梯度稀釋后加入裂解液（pH8.0）抽提，用細(xì)菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結(jié)果見圖1。吸取的菌體量減少到100倍，PCR條帶可以；吸取的菌體量減少到1000倍，仍有PCR條帶。正常吸取的菌體量波動(dòng)在10倍以內(nèi)，因此菌體吸取量對(duì)PCR鑒定無影響。

2.1.2 提取液pH對(duì)PCR的影響 吸取長(zhǎng)雙歧桿菌劃線平板上的單菌落菌體，加入不同pH裂解液抽提，用細(xì)菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結(jié)果見圖2所示。pH8.0的效果較差，pH8.3和pH8.6的效果都較好；pH 8.9的沒有PCR條帶，可能沸水浴時(shí)模板DNA降解或者裂解液影響隨后PCR體系的pH。考慮到PCR緩沖液的pH8.3，因此，裂解液的最佳pH 8.3。

圖2 提取液pH對(duì)PCR影響Fig.2 The effectof DNA extraction pH for PCR product

2.1.3 抽提方法通用性 抽提方法通用性決定著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。吸取不同益生菌的劃線平板單菌落菌體，加入裂解液（pH 8.3），提取菌體DNA，用細(xì)菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結(jié)果見圖3。不同細(xì)菌的抽提物都有PCR條帶且都較強(qiáng)，說明本研究的菌體DNA抽提方法的通用性好。

圖3 抽提方法通用性Fig.3 Generality of themethod for extracting bacterial genomic DNA

2.2 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR引物特異性驗(yàn)證

圖4 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR引物特異性Fig.4 Specificity of the PCR primers for Bifidobacterium longum

對(duì)包括長(zhǎng)雙歧桿菌在內(nèi)8種的不同益生菌，分別吸取單菌落菌體，加入裂解液（pH 8.3），提取菌體DNA，用長(zhǎng)雙歧桿菌定性引物和細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)記引物做PCR，電泳結(jié)果見圖4。所有細(xì)菌的陽(yáng)性標(biāo)記PCR都有條帶；但長(zhǎng)雙歧桿菌定性PCR只特異性擴(kuò)增長(zhǎng)雙歧桿菌（圖4中編號(hào)為4、5），而其它細(xì)菌，特別與它相近的雙歧桿菌（如動(dòng)物雙歧桿菌等）都沒有擴(kuò)增條帶。本實(shí)驗(yàn)說明長(zhǎng)雙歧桿菌定性PCR的特異性強(qiáng)，可以作為益生菌混合培養(yǎng)的計(jì)數(shù)。

2.3 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR計(jì)數(shù)結(jié)果

2.3.1 長(zhǎng)雙歧桿菌PCR計(jì)數(shù) 長(zhǎng)雙歧桿菌酸奶經(jīng)過平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，得到長(zhǎng)雙歧桿菌可疑菌落數(shù)總數(shù)為6.5×108cfu/g。隨機(jī)選擇20個(gè)分散的菌落，編號(hào)標(biāo)記，用滅菌槍頭吸取菌體，在平板空白處吸取培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照監(jiān)測(cè)PCR污染。提取菌體DNA，做PCR鑒定。PCR產(chǎn)物電泳條帶分為以下三種情況：

a.只有細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)志擴(kuò)增條帶（300bp左右）而無長(zhǎng)雙歧桿菌擴(kuò)增條帶（215bp），則所檢測(cè)的菌落不是長(zhǎng)雙歧桿菌，而是其他細(xì)菌。

b.細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)志和長(zhǎng)雙歧桿菌2條擴(kuò)增條帶都沒有，則所檢測(cè)的菌落基因沒有裂解好或沒有吸到菌體。

c.有細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)志和長(zhǎng)雙歧桿菌2條擴(kuò)增帶，則所檢測(cè)的菌落為長(zhǎng)雙歧桿菌。

所選取的20個(gè)菌落都有細(xì)菌陽(yáng)性標(biāo)志PCR條帶，其中14個(gè)為長(zhǎng)雙歧桿菌，比率為7∶10；乘上BBL瓊脂平板計(jì)數(shù)結(jié)果（6.5×108cfu/g），得到所檢測(cè)的酸奶中長(zhǎng)雙歧桿菌的菌落數(shù)為4.6×108cfu/g。陰性對(duì)照的2對(duì)PCR引物都沒有條帶，說明培養(yǎng)基中含有的核酸物質(zhì)不能擴(kuò)增，對(duì)PCR鑒定計(jì)數(shù)沒有影響。

圖5 長(zhǎng)雙歧桿菌平板計(jì)數(shù)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR bands of the colonies by Bifidobacterium longum plate count

2.3.2 鏡檢驗(yàn)證 對(duì)2.3.1所述平板上對(duì)應(yīng)編號(hào)的20菌落，全部涂片鏡檢。結(jié)果通過長(zhǎng)雙歧桿菌PCR鑒定為陽(yáng)性菌落的菌體形態(tài)都如圖7相似，為雙歧桿菌的典型特征（長(zhǎng)而彎曲的桿狀[13]）；所有陰性菌落顯微圖片都如圖6相似，為球菌；鏡檢中未發(fā)現(xiàn)其它桿菌。鏡檢結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證PCR計(jì)數(shù)方法的特異性和準(zhǔn)確性，沒有交叉污染。

3 結(jié)論

本研究將PCR技術(shù)與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來，初步建立了混合發(fā)酵酸奶中長(zhǎng)雙歧桿活菌計(jì)數(shù)方法。操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，抗干擾強(qiáng)，試劑無毒、無害，能夠計(jì)數(shù)樣品中活活菌，適合混合細(xì)菌樣品中的特定益生菌活菌計(jì)數(shù)研究。通過設(shè)計(jì)菌株特異性PCR引物可以區(qū)分同種不同菌株的細(xì)菌，為益生菌的研究和應(yīng)用打下基礎(chǔ)；同時(shí)也為其它計(jì)數(shù)方法提供參考標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)與鑒定需要進(jìn)行培養(yǎng)和一系列生化反應(yīng)檢測(cè)，方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，需要至少2~3d時(shí)間；而PCR鑒定計(jì)數(shù)過程可以在1d之內(nèi)完成，因此本研究計(jì)數(shù)方法快速、準(zhǔn)確。

研究出的抽提方法操作簡(jiǎn)便、高效、靈敏、通用，同時(shí)可以克服培養(yǎng)基中污染基因物質(zhì)干擾。抽提方法的靈敏性決定著PCR計(jì)數(shù)方法的靈敏性，正常吸取菌體量稀釋100倍仍有PCR擴(kuò)增條帶，充分保證PCR計(jì)數(shù)方法的可靠性和靈敏性。只要待檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)菌含量可以用常規(guī)平板計(jì)數(shù)方法的，都可以用PCR進(jìn)行菌落鑒定計(jì)數(shù)。

總之，本研究為食品中益生菌菌數(shù)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)；為開發(fā)和生產(chǎn)高質(zhì)量的發(fā)酵乳產(chǎn)品提供研究基礎(chǔ)。

圖6 非長(zhǎng)雙歧桿菌菌落顯微圖Fig.6 Micrograph of the non-Bifidobacterium longum colony

圖7 長(zhǎng)雙歧桿菌菌落顯微圖片F(xiàn)ig.7 Micrograph of the Bifidobacterium longum colony

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Study on a new method for counting Bifidobacterium longum in yogurt by PCR

ZHANG Hong-fa1，2，REN Jing1，LIU Jing1，YOU Chun-ping1，GU Jin-lin1
（1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai200436，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

This study tried to initially estab lish a method for counting Bifidobac terium longum in yogurt by using polymerase chain reaction（PCR）technique and traditionalp late countmethod technique.Based on the conserved sequence of 16S rDNA sequences of bacteria，a pair of universal p rimer were designed as a positive mark. And a pair of special p rimers were also designed and synthesized accord ing to 16S～23S rRNA gene of the Bifidobacterium longum.The random ly selected colonies of the m ixed fermented yogurt culturing on BBL agar p late were abstracted and identified by PCR.PCR technology combines w ith the trad itional p late countmethod technology，estab lished the method for counting the living Bifidobacterium longum in the m ixed fermented yogurt.Operation of extraction method must be sim p le，efficient，responsive and accurate，and it determ ined the efficient of PCR counting method.This study focused on the factors that influencing the bacterial DNA extraction，as well as the versatility of the bacterial DNA extraction，but also the specificity of the PCR p rimers for Bifidobac terium longum.A method for counting Bifidobacterium longum in yogurtwas initially estab lished by using polymerase chain reac tion（PCR）technique and trad itionalp late countmethod technique.

PCR；counting；Bifidobacterium longum

TS252.54

A

1002-0306（2012）14-0188-04

2011－10－28

張紅發(fā)（1977-），男，本科，中級(jí)職稱，主要從事乳品微生物方面的研究。

乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室籌建項(xiàng)目（10dz2221100）；上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（09DZ2251400）。