張海生，孫 鍵，張瑞妮，張澤炎

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

綠豆抗氧化活性肽的分離純化及其組成分析

張海生，孫 鍵，張瑞妮，張澤炎

（陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710062）

采用超濾法和Sephadex G-25凝膠色譜法對綠豆蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化，得到了分子量為3426和1272u的兩種綠豆抗氧化活性肽T1和T2，T1的純度為85.92%，T2的純度為94.99%，T1和T2均含有16種相同的氨基酸，表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力，T1對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別為69.14%和58.62%；T2對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別為91.70%和74.68%。

綠豆抗氧化肽，分離，活性，組成

人類許多慢性疾病及衰老現(xiàn)象均和人體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān)，過量的自由基對機(jī)體產(chǎn)生氧化性損傷，當(dāng)這種損傷不能及時(shí)修復(fù)并且積累到一定程度時(shí)會導(dǎo)致各種疾病[1-2]，特別是癌癥、心血管疾病和炎癥性疾病[3-4]的發(fā)生。綠豆又稱青小豆、植豆、錄豆，是豆科豇豆屬一年生草本植物綠豆（Phaseolus radiatus）的成熟種子，不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還具有清熱解毒、抗炎消腫、消暑利尿、保肝明目、潤肌膚、降血壓、防止動脈粥樣硬化等藥效作用[5]，是一種優(yōu)質(zhì)食品資源。國內(nèi)外有關(guān)綠豆多肽的制備工藝文獻(xiàn)報(bào)道較多，如李楊等[6]研究了Protex-6L堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的工藝，屠春燕等[7]研究了A lcalase堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備分子量1000u以下的小分子多肽的工藝，而對綠豆活性肽特別是綠豆抗氧化活性肽的分離純化技術(shù)、組成分析研究的文獻(xiàn)報(bào)道鮮見。本文以綠豆蛋白為原料，通過酶解方法制備綠豆抗氧化活性肽，對所制備的綠豆抗氧化活性肽的分離純化技術(shù)進(jìn)行研究，并對其氨基酸組成進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

脫皮綠豆 產(chǎn)地東北；Sephadex G-25 PHAAMCIA公司；DPPH、牛血清蛋白 Sigma公司；藍(lán)色葡聚糖凝膠-2000 PHAAMCIA公司；L-谷胱甘肽、谷胱甘肽 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；VB12沃爾森生物科技公司；乙腈 HPLC純，美國Dikma公司；乙醇、重鉻酸鉀等化學(xué)試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水 為去離子蒸餾水。

DBS-100電腦全自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；Breeze1525高效氣相色譜儀 美國Waters公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；U-3010紫外分光光度計(jì) 日本日立公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本H ITACHI公司；8200230超濾膜分離設(shè)備 美國Milipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆蛋白粉的制備 用多功能粉碎機(jī)將脫皮綠豆粉碎，過100目篩備用。稱取一定量的脫皮綠豆粉于大燒杯中，以1∶15的料水比加入蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.0±0.02，在40℃水浴鍋中不斷攪拌提取20min。堿提完成后，在4020r/min條件下，離心20m in，取上清液。用HCl溶液調(diào)節(jié)上清液的pH為4.5± 0.02，靜置30m in，使綠豆蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處凝聚沉淀。所制得的綠豆蛋白粉中蛋白質(zhì)含量為75.97%。

1.2.2 綠豆抗氧化活性肽的制備 綠豆抗氧化活性肽的制備采用中性蛋白酶水解法，酶解工藝參數(shù)為：底物濃度為2%，酶解pH 6.5，酶解溫度50℃，加酶量5000U/g，酶解時(shí)間120min。酶解液離心分離后，上清液即為含綠豆抗氧化活性肽的水解液。

1.2.3 綠豆抗氧化活性肽的超濾分離 水解液先用0.45μm的微孔濾膜過濾后，依次用分子量截留30、10、5、1ku的膜組件，在室溫條件下，進(jìn)行超濾分離，入口壓力0.7bar、出口壓力0.3bar，將綠豆蛋白水解液按分子量大小分為五組，分子量范圍依此為1ku以下、1～5、5～10、10～30ku和30ku以上。將所得的五組樣液，分別在40℃下真空濃縮，然后冷凍干燥備用。

1.2.5 羥自由基清除能力的測定 參考Avellar等的方法[8]。取0.75mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液1m L于試管中，依次加入磷酸鹽緩沖溶液2m L和蒸餾水1m L，充分混均后，加0.75mmol/L的FeSO41m L，加完后快速混和均勻，加0.01%H2O21m L，在37℃水浴保溫60min，然后用紫外分光光度計(jì)在536nm處測吸光度，得A1。用1m L蒸餾水代替1m L H2O2，1m L樣品溶液（濃度20mg/m L）代替1m L蒸餾水，其它同前，測得吸光度為A0。用1m L樣品溶液代替1m L蒸餾水，其它同前，測得吸光度為As。按下式計(jì)算羥自由基的清除率：

1.2.6 DPPH自由基清除能力的 參考曹煒等的方法[9]。準(zhǔn)確稱取DPPH，用少量無水乙醇溶解后用50%乙醇配成2×10－4mol/L的溶液。取20mg/m L的樣品溶液2m L于試管中，加入2×10－4mol/L的DPPH自由基溶液2m L充分混勻，放置30min后在517nm波長下測定吸光值記為Ai；取20mg/m L的樣品溶液2m L于試管中，加入2m L 70%乙醇，混勻30m in后，在517nm波長下測定其吸光值記為Aj；取2×10－4mol/L的DPPH自由基溶液，在517nm波長下測定其吸光值記為A0。用維生素C作為陽性對照。按照下式計(jì)算DPPH自由基的清除率。

1.2.7 Sephadex G－25凝膠色譜分離 色譜柱規(guī)格1.2cm×80cm，采用濕法裝柱。樣品溶液濃度20mg/m L，進(jìn)樣量2m L，采用去離子水洗脫，洗脫流速0.5m L/m in，紫外檢測波長220nm，檢測靈敏度0.2A，用自動部分收集器按峰收集在220nm處有吸收峰的洗脫液。

1.2.8 綠豆抗氧化活性肽相對分子質(zhì)量分布的測定

選擇L－谷胱甘肽，谷胱甘肽，VB12，牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。按照凝膠色譜確定的條件及方法，用藍(lán)色葡聚糖凝膠－2000測出外水體積Vo，用重鉻酸鉀測出內(nèi)水體積Vt。然后將標(biāo)品分別上柱洗脫，測其紫外吸光度，求出標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫體積Ve和分配系數(shù)Kav（Kav=（Ve－Vo）/（Vt－Vo）），以Kav為橫坐標(biāo)，lgM為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程lgM=A×Kav+B。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測樣品各個(gè)洗脫峰的分子量范圍。

1.2.9 綠豆抗氧化活性肽的純度鑒定 采用高效液相色譜法鑒定經(jīng)Sephadex G－25凝膠色譜分離制得的綠豆抗氧化活性肽T1和T2的純度。色譜條件：色譜柱為ODS色譜柱，洗脫液為1∶8的乙腈∶水溶液，樣品濃度為0.5mg/m L，上樣量為20μL，流速為0.4m L/m in，檢測波長為220nm。

1.2.10 綠豆抗氧化活性肽的氨基酸組成分析 取一定量的樣品，用6mol/L HCl在110℃溫度下水解22h，抽酸、定容。用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆抗氧化活性多肽的超濾分離

綠豆蛋白水解液經(jīng)超濾分離后得到分子量大小不同的五個(gè)組分，各組分的得率如表1所示。由表1可知，綠豆蛋白經(jīng)中性蛋白酶水解后，水解產(chǎn)物主要集中在1～30ku分子量范圍內(nèi)，其中以分子量為1～5ku略占多數(shù)，占31%；其次為分子量5～10ku和10～30ku的，分別占26%和22%。各組分對羥自由基和DPPH自由基的清除率如圖1所示。由圖1可知，分子量1～5ku的組分清除羥自由基的能力和清除DPPH自由基的能力均明顯高于其他組分，其對羥自由基和DPPH自由基的清除能力分別為65.91%和40.89%；分子量＜1、5～10、10～30ku和分子量＞30ku的其他4個(gè)組分也都表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。由此可知，在綠豆酶解產(chǎn)物中，分子量1～5ku的組分不僅數(shù)量最多，而且其抗氧化活性也最高。因此選擇分子量在1～5ku范圍內(nèi)的酶解產(chǎn)物作為進(jìn)一步的研究對象，進(jìn)行深入的研究。

表1 酶解產(chǎn)物的分子量分布Table 1 Themolecularweight distribution of enzymatic hydrolysates

圖1 不同分子量酶解產(chǎn)物對自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effectof differentmolecular weightenzymatic hydrolysates against free radicals

2.2 綠豆抗氧化活性肽的Sephadex G-25凝膠色譜分離純化

由Sephadex G-25凝膠色譜分離圖（圖2）可以看出，分子量1~5ku范圍內(nèi)的酶解產(chǎn)物采用Sephadex G-25凝膠柱色譜分離時(shí)，有兩個(gè)明顯的洗脫峰，分別收集這兩個(gè)洗脫峰的洗脫液，便獲得酶解產(chǎn)物的兩個(gè)分離組分T1和T2。組分T1和T2對羥自由基和DPPH自由基的清除效果如圖3所示。由圖3可以看出，組分T1和T2對羥自由基和DPPH自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，組分T1對羥自由基和DPPH自由基的清除能力分別為69.14%和58.62%；組分T2對羥自由基和DPPH自由基的清除能力分別為91.70%和74.68%，兩組分均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖2 Sephadex G-25凝膠色譜圖Fig.2 Sephadex G-25 chromatogram of enzymatic hydrolysates

圖3 組分T1和T2對羥自由基和DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging effectof T1 and T2 againstOH·and DPPH·

2.3 綠豆抗氧化活性肽的分子量分布測定

由標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)色葡聚糖凝膠-2000測得凝膠柱的外水體積Vo=34m L，用重鉻酸鉀測出凝膠柱的內(nèi)水體積Vt=89.2m L。分別對各個(gè)標(biāo)品進(jìn)行凝膠柱色譜分離，得到了各個(gè)標(biāo)品的洗脫體積Ve及分配系數(shù)Kav。以Kav值為橫坐標(biāo)，lgM為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。由圖4可得回歸方程：y=-3.7104x+5.2153，回歸方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9982，說明lgM與Kav呈線性相關(guān)。

圖4 標(biāo)品的lgM與Kav的關(guān)系圖Fig.4 Linear relationship between lgM and Kav of standard protein

用Sephadex G-25凝膠柱色譜對分子量1~5ku范圍內(nèi)的酶解產(chǎn)物分離時(shí)，得到了兩個(gè)洗脫峰，第一個(gè)洗脫峰的洗脫體積為59m L，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出其對應(yīng)的分子量為3426u；第二個(gè)洗脫峰的洗脫體積為62.5m L，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得其對應(yīng)的分子量為1272u。

2.4 綠豆抗氧化活性肽的純度鑒定

圖5 綠豆抗氧化活性肽T1的HPLC色譜圖Fig.5 The chromatogram ofmung bean antioxidant peptide T1

圖6 綠豆抗氧化活性肽T2的HPLC色譜圖Fig.6 The chromatogram ofmung bean antioxidant peptide T2

應(yīng)用HPLC法對分離純化后的綠豆抗氧化活性肽TⅠ和T2的純度進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果如圖5和圖6。由HPLC色譜圖可以看出，T1和T2不是單一組分，但雜峰所占比例很小，主峰所占得比例很高，根據(jù)面積歸一法可得出T1和T2的純度分別為85.92%和94.99%。說明經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱色譜分離純化后的綠豆抗氧化活性肽T1和T2的純度可以滿足更深入研究的需要。

2.5 綠豆抗氧化活性肽的氨基酸組成分析

采用全自動氨基酸分析儀對純化后的綠豆抗氧化活性肽T1和T2的氨基酸組成進(jìn)行了檢測，測得綠豆抗氧化活性肽T1和T2含有16種相同的氨基酸（表2），其氨基酸總量分別為65.55%和85.11%，其中必須氨基酸分別占氨基酸總量的22.97%和27.22%。十六種氨基酸中，谷氨酸含量最高。

3 結(jié)論

綠豆酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離，被分離成分子量大小不同的五種組分，其中分子量1~5ku的組分所占的比例最大，抗氧化能力最強(qiáng)，經(jīng)SephadexG-25凝膠色譜進(jìn)一步分離純化后，得到了3426和1272u兩種分子量的綠豆抗氧化活性肽T1和T2，T1的純度為85.92%，T2的純度為94.99%。T1和T2都由16種相同的氨基酸組成，均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，T1對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別為69.14%和58.62%；T2對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別為91.70%和74.68%。

表2 綠豆抗氧化活性肽的氨基酸組成及含量（%）

Table 2 Amino acids composition and contentofmung bean antioxidant peptides（%）

氨基酸 T1 T1天冬氨酸 7.87 11.71蘇氨酸 1.89 2.81絲氨酸 3.48 5.09谷氨酸 12.72 17.66甘氨酸 2.15 3.05丙氨酸 3.22 4.32纈氨酸 3.28 3.89蛋氨酸 0.92 0.99異亮氨酸 2.70 3.49亮氨酸 5.28 5.82酪氨酸 2.36 1.69苯丙氨酸 4.38 3.41賴氨酸 4.52 6.81組氨酸 1.71 2.56精氨酸 4.66 5.32脯氨酸 2.29 4.86必需氨基酸合計(jì) 22.97 27.22非必需氨基酸合計(jì) 42.58 57.89總計(jì) 65.55 85.11

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Separation and com position analysis of antioxidant peptide from mung bean

ZHANG Hai-sheng，SUN Jian，ZHANG Rui-ni，ZHANG Ze-yan
（Food Engineering and Nutrition Science College，ShaanxiNormal University，Xi’an 710062，China）

Two kinds of antioxidant pep tides（named antioxidant pep tide T1and antioxidantpep tide T2separately）were separated from mung bean hyd rolysates p roduced by neutral p rotease w ith ultrafiltration and Sephadex G-25 gelchromatog raphy.Themolecularweightof antioxidantpep tide T1was 3426u and its purity was 85.92%. The molecular weight of antioxidant pep tide T2was 1272u and its purity was 94.99%.Both of these two kinds of antioxidant pep tide which were com posed of sixteen kinds of am ino acids p resented strong antioxidant capacity.The scavenging rates of pep tide T1against hyd roxyl radical and DPPH radical were 69.14%and 58.62%separately and the scavenging rates of pep tide T2against these two kind rad icals were 91.70%and 74.68%separately.

antioxidant pep tide ofmung bean；separation；ac tivity；com position

TS210.1

A

1002-0306（2012）14-0153-04

2011－11－18

張海生（1965-），博士，副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工和功能食品的研究開發(fā)工作。