史斌斌，徐 巖，范文來

（教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫 214122）

頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯

史斌斌，徐 巖，范文來*

（教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇無錫 214122）

運用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS），建立了快速定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯（EC）的方法。優(yōu)化了影響EC檢測的因素，包括酒精度、萃取溫度和萃取時間。該方法在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2＞0.99），檢測限1.16μg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）1.26%~12.51%，在不同類型（香型）蒸餾酒中回收率為89%~119%。結(jié)果表明，該方法選擇性和靈敏性良好，適合酒精度較高的蒸餾酒中EC的研究。最后，采用此方法對成品蒸餾酒進(jìn)行了定量檢測分析。

蒸餾酒，頂空固相微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜，氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（EC），是一種自然產(chǎn)生于發(fā)酵食品和飲料酒中的化合物，主要是在發(fā)酵過程、加熱（如蒸餾）和儲存時形成[1]。二十世紀(jì)初，EC曾用于麻醉劑[2]，但到四十年代時人們發(fā)現(xiàn)EC具有致癌性[3]。2007年3月，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)把EC由2B類致癌物提升為2A類致癌物[4-5]。二十世紀(jì)八十年代開始，EC的檢測方法得到廣泛研究，國內(nèi)對于飲料酒的研究逐漸增多。樣品預(yù)處理方法有液液萃取[6]、固相萃取[7-9]、固相微萃取[10-11]以及衍生化[12]等；EC定量方法主要有GC-MS法[6-8]與HPLC法[12-13]；不采用預(yù)處理直接進(jìn)行分析則需要二維或多維色譜檢測技術(shù)[14-15]。早期飲料酒中EC的分析是采用液液萃取[6]，如1993年制定的關(guān)于出口酒類（包括蒸餾酒和黃酒）中氨基甲酸乙酯殘留量檢測[16]，就是采用二氯甲烷液液微萃取。近年來的報道中多是采用固相萃取進(jìn)行預(yù)處理[7-9，17]，采用此方法測得EC含量為6.4~485.5g/kg。HS-SPME方法也是近年來新發(fā)展起來的方法[10-11，17]，可用于葡萄酒、黃酒、啤酒等飲料酒的分析，是目前為止報道的最簡單快速、自動化程度高的定量方法。本研究的建立主要是基于HS-SPME方法蒸餾酒中EC的快速檢測方法。與以往報道的定量方法相比，該方法同時具有自動化程度高、過程簡便快速、檢測限比較低、線性范圍廣且樣品用量少的優(yōu)點。該方法一直沒有應(yīng)用于白酒，卻已成熟地用于葡萄酒、黃酒和清酒等的定量，主要是由于蒸餾酒的酒精度比較高，不能像其他飲料酒一樣直接用于檢測，因此，需采用旋蒸預(yù)處理，降低酒精度，再將HS-SPME結(jié)合GC-MS用于定量檢測蒸餾酒中的EC。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基甲酸丙酯（PC）、氨基甲酸乙酯（EC） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；實驗專用水 超純水（Milli-Q系統(tǒng)，M illipore，Bad ford，MA，USA）經(jīng)過煮沸5m in所得；蒸餾酒樣品 白酒由國內(nèi)相應(yīng)酒廠提供；白蘭地 在超市購買；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；固相微萃取頭（PA、DVB/CAR/PDMS、PDMS） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；GC 6890N-MSD 5975型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品SPME處理 蒸餾酒中EC的萃?。喝?0m L蒸餾酒樣，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到10m L，水洗旋蒸瓶三次，用水定容到原體積（20m L）。吸取8m L于20m L頂空瓶中，加入5μL內(nèi)標(biāo)氨基甲酸丙酯，加入3g氯化鈉。插入萃取頭，預(yù)熱后在70℃下用PA萃取頭吸附45m in，然后250℃解吸附5m in。

1.2.1.1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)損失率 配制50%vol的模擬酒樣，分別在旋蒸前和旋蒸后添加150μg/L的EC標(biāo)準(zhǔn)品作為對比，經(jīng)過相同的HS-SPME結(jié)合GC-MS處理后計算旋蒸的損失率。

1.2.1.2 單因素實驗 首先考察不同的酒精度對萃取效果的影響。由于旋蒸過后酒樣的酒精度基本在10%vol左右，因此需要確定在0%~20%vol的范圍內(nèi)酒精度對EC萃取時的影響。

其次，萃取條件的優(yōu)化主要包括萃取溫度和萃取時間。萃取溫度主要對50、60、70℃進(jìn)行實驗；萃取時間主要對15、30、45m in進(jìn)行實驗。

1.2.1.3 萃取條件正交實驗 配制10%vol的模擬酒樣，添加150μg/L的EC標(biāo)準(zhǔn)品，取9份進(jìn)行正交實驗。正交條件包括：萃取頭：PA、DVB/CAR/PDMS、PDMS；萃取時間：30、45、60m in；萃取溫度：60、70、80℃設(shè)計了三因素三水平正交實驗見表1。

表1 正交實驗的因素和水平Table 1 Factors of orthogonal experimental

1.2.2 GC-MS方法

1.2.2.1 GC條件 進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速2m L/min，不分流進(jìn)樣，色譜柱為DB-FFAP（60m× 0.25mm×0.25μm，J&W Scientific）。檢測時的升溫程序為：50℃恒溫2m in，以5℃/m in的速度升溫至170℃，再以10℃/m in的速度升溫至230℃，保持5m in。

1.2.2.2 MS條件 EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35.00~350.00amu。MS檢測器采用SIM模式，特征離子62用于EC和內(nèi)標(biāo)PC兩種物質(zhì)的定量。質(zhì)譜分析用數(shù)據(jù)庫NIST05a1L。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品配制到色譜純無水乙醇中，稀釋成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到模擬酒樣中?？紤]到所測蒸餾酒樣品的酒精度為40%~65%，所以模擬酒樣是用實驗專用水與色譜純無水乙醇配制的50%vol乙醇水溶液，模擬酒樣采用與真實酒樣同樣的處理過程。利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以待測物EC峰面積與內(nèi)標(biāo)PC峰面積之比為橫坐標(biāo)（x），待測物EC濃度與內(nèi)標(biāo)PC濃度之比值為縱坐標(biāo)（y），直線回歸，對目標(biāo)化合物進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPME萃取條件選擇

為確定SPME最佳的萃取條件，分別考察了酒精度對萃取效果的影響，采用單因素實驗選出最優(yōu)萃取時間和萃取溫度，并采用正交實驗考察了萃取頭、萃取溫度和萃取時間的選擇對檢測方法靈敏性的影響。

2.1.1 酒精度對萃取效果的影響 乙醇濃度直接影響萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)的吸附。隨著酒精度增高，吸附效果會降低[10]，甚至有可能產(chǎn)生萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)和乙醇的競爭性吸附。蒸餾酒的酒精度較高，如直接萃取則不利于酒中EC的富集。

圖1 不同酒精度模擬酒樣中EC含量Fig.1 Influence of different alcoholic content in synthetic liquor

在進(jìn)行SPME萃取之前需要對樣品進(jìn)行處理。如采用直接稀釋樣品來獲得適當(dāng)?shù)木凭萚13，18]，則會導(dǎo)致EC濃度過低而難以檢測。過去的液液萃取或者固相萃取后有機(jī)溶劑比較多的情況下會采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮[6，19-20]，考慮到EC的水溶性以及沸點，確定采用旋蒸法除去酒樣中大部分酒精和一些低沸點干擾物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，樣品酒精度基本在10%vol左右。當(dāng)酒精度為10%vol時，PA頭對PC的吸附與酒精度20%vol時結(jié)果類似，即EC峰面積變化不大見圖1。這一結(jié)果也表明，應(yīng)用HS-SPME檢測葡萄酒、啤酒以及清酒時，不需要去除樣品中酒精。

2.1.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理方法的損失率 由于蒸餾酒的酒精度比較高，不能像葡萄酒、黃酒或者清酒分析時一樣直接進(jìn)行HS-SPME處理，需要旋蒸除去大部分酒精后才能進(jìn)行分析。雖然有采用旋蒸進(jìn)行EC預(yù)處理的報道[6，12-13，19-20]，但考慮到旋蒸可能會在造成EC的損失，因此，通過損失率實驗來確定旋蒸時EC的損失。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)損失率實驗結(jié)果如表2所示，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)造成EC的損失不超過10%。不過，當(dāng)旋蒸用于白酒樣品的預(yù)處理時，最后的計算結(jié)果需要考慮到損失率才是原來白酒中EC的含量。

表2 旋蒸方法中EC損失率Table 2 Percentage of EC loss for rotary evaporatormethod

2.1.3 萃取溫度選擇 單因素實驗結(jié)果表明，在70℃時EC的萃取效果最好，萃取出來EC的量完全可以滿足定量分析的要求。Lachenmeier[21]的研究結(jié)果也表明，萃取溫度從50～70℃的過程中EC萃取量增加，而80℃萃取時EC的量反而減少，說明溫度過高，萃取的物質(zhì)也會增多，加劇與EC的競爭，同時高溫會造成EC的解吸，這樣反而會使得EC吸附量減少。近年來的其他飲料酒的報道中萃取溫度均為70℃[10－11，21－22]。因此，最優(yōu)萃取溫度選70℃。

2.1.4 萃取時間選擇 在進(jìn)行固相微萃取時，開始萃取達(dá)到萃取平衡所需時間，是由多種因素決定的。由于EC是半揮發(fā)性物質(zhì)，在70℃時萃取120m in后都未能達(dá)到平衡[10]。日本的最新報道[22]指出只要精確的控制吸附時間，萃取不需要達(dá)到飽和就可以取得很好的效果，只是樣品的處理時間最好不超過GC總的運行時間，單因素實驗結(jié)果證明，45m in的萃取效果最好，所以最佳萃取時間為45min。

2.1.5 正交實驗 采用設(shè)計的正交方法對萃取頭，萃取時間，萃取溫度進(jìn)行了三因素三水平的正交實驗。

表3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of orthogonal experimental

極差分析結(jié)果（見表3）表明，萃取頭對實驗的影響最大，因此，最重要的條件是選擇效果較好的萃取頭PA。其次再選擇最佳的萃取時間和萃取溫度。在采用PA萃取頭進(jìn)行分析時，其效果明顯好于其他兩種萃取頭。隨著萃取時間的延長以及萃取溫度的升高，PA對EC的萃取量并沒有升高，反而降低，說明萃取溫度的過高會增大目標(biāo)物吸附時的競爭，甚至造成目標(biāo)物的解吸，即使萃取時間較長，也沒有萃取溫度較低時的效果好。

因此，最佳條件是采用PA萃取EC，最佳溫度是70℃下萃取45m in。此結(jié)果與烈酒、黃酒和清酒相關(guān)文獻(xiàn)報道的最優(yōu)萃取條件相符[10，21－22]?？梢姡?jīng)過旋蒸處理后，HS－SPME方法同樣可以用于酒精度較高的蒸餾酒中EC的定量。

2.2 方法評價

表4 EC定量方法的線性及檢測限Table 4 Method linearity of EC in Chinese liquor using the HS－SPMEmethod

由表4可知，該方法對于目標(biāo)物質(zhì)有很寬的線性范圍，并且在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系很好（R2＞0.99），說明該方法的適用范圍較廣。以信噪比等于3為標(biāo)準(zhǔn)，計算該定量檢測方法的檢測限（LOD），結(jié)果表明，檢測限遠(yuǎn)低于白酒中EC的含量。

另外，在不同香型酒樣中添加相近濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，計算回收率，同時通過重復(fù)性實驗檢驗了該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表5可知，該方法對于EC的檢測具有很好的準(zhǔn)確性和精確性，完全能夠滿足分析檢測的要求。

表5 方法精密度（n=3）和回收率Table 5 Relative recovery and precision of EC detected in differentaroma type liquors

2.3 蒸餾酒中EC的檢測

利用建立的定量方法，檢測了五種香型白酒以及三種白蘭地樣品。所得幾種蒸餾酒的EC含量如表6。

由表6可知，蒸餾酒中EC的含量相對來說還是比較高的，國外規(guī)定蒸餾酒中EC的含量不超過150μg/L[23]，但是在檢測的樣品中，很多蒸餾酒中的含量折算為國外的標(biāo)準(zhǔn)（40%vol）后都是接近這個標(biāo)準(zhǔn)，有的樣品中EC含量甚至超過了這個標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)有關(guān)白酒的分析結(jié)果[7－9]也表明，EC含量分別為6.4～485.5g/kg，可見不同地區(qū)不同香型的白酒之間EC的差別還是很大的。

3 結(jié)論

表6 各種蒸餾酒中EC的含量Table 6 Relative recovery and precision of EC detected in differentaroma type liquors

經(jīng)過對SPME方法的幾個參數(shù)：酒精度的影響，萃取溫度和萃取時間的選擇進(jìn)行優(yōu)化，建立了頂空固相微萃取技術(shù)（HS－SPME）結(jié)合氣相色譜－質(zhì)譜（GCMS）的定量方法。該方法具有簡便快速、靈敏以及自動化程度高的優(yōu)點，能夠?qū)φ麴s酒中EC進(jìn)行簡捷、快速定量。

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Detection method of ethyl carbamate in distillates by headspace solid-phase m icroextraction coup led w ith gas chromatography-mass spectrometry

SHIBin-bin，XU Yan，F(xiàn)ANW en-lai*
（Key Lab of Industrial Biotechnology，Lab of Brewing Microbiology and Applied Enzymology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A rap id quantitative method of ethyl carbamate（EC）in d istillates using headspace solid-phase m icroextraction（HS-SPME）follow ing by gas chromatog raphy-mass spec trometry（GC-MS）was p resented. The extraction cond itions of HS-SPMEwere op tim ized in order to get the op timum conditions for the analysis of EC.The op tim ized condition consisted of ethanol content，extraction tem perature and extraction time.The method showed good linearity（R2＞0.99）over the concentration ranges.The detection lim it，relative standard deviation（RSD），recovery were 1.16μg/L，1.26%～12.51%，and 89%～119%，respectively，which indicated that the p resented analyticalmethod p rovided a selec tive and sensitive technique to quantify EC in d istilled liquors. Finally，this method would be used for quantitative analysis of d istilled liquors.

d istillate；headspace solid-phase m icroextrac tion；gas chromatog raphy-mass spectrometry；ethyl carbamate

TS201.2

A

1002-0306（2012）14-0060-04

2011－11－21 *通訊聯(lián)系人

史斌斌（1985-），男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

國家十二五科技支撐計劃項目（2012BAK17B11）。