翟麗莎，馮 佳，謝樹蓮

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

泡狀饒氏藻[Jaoa bullata(Jao)Fan］屬綠藻門(Chlorophyta)綠藻綱(Chlorophyceae)。該種于1947年由饒欽止先生從貴州省湄潭縣小河急流中的巖石上發(fā)現(xiàn)并命名為 Coelodiscus bullatus[1］，隸屬饒先生之前建立的空盤藻科(Coelodiscaceae)空盤藻屬(Coelodiscus)[2-4］。泡狀饒氏藻和饒氏藻[Jaoa prasina(Jao)Fan］是饒氏藻屬僅有的2個(gè)種，為我國特有種(也有文獻(xiàn)認(rèn)為泡狀饒氏藻只是饒氏藻的1個(gè)變種[5-7］)。自該科屬建立以來，有的將其歸于絲藻 目 (Ulotrichales)[8］，有 的 歸 于 膠 毛 藻 目(Chaetophorales)[5，6］，有的歸于 Ctenocladales[7］.也有根據(jù)形態(tài)特點(diǎn)，將其歸于石莼目(Ulvales)[9，10］?？梢姡湎到y(tǒng)位置一直是一個(gè)存在爭議的問題。

tufA基因是葉綠體基因組中4個(gè)翻譯因子基因的其中之一，編碼翻譯延長因子亞基，具有促進(jìn)翻譯的功能。tufA已被用于區(qū)別綠藻物種的系統(tǒng)發(fā)育分析[11］。Gary的研究表明，tufA基因具有高辨識(shí)力、普遍性及好的序列質(zhì)量，且污染水平較低[12］。

以往對(duì)饒氏藻的研究多在形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)方面[9，13-14］。筆者通過試驗(yàn)測定了泡狀饒氏藻的tufA基因序列，并與Genbank獲得的綠藻門其它類群的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，分析它們之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步研究饒氏藻的系統(tǒng)位置提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為泡狀饒氏藻，采自山西省平定縣娘子關(guān)泉。樣品采集后，用于形態(tài)觀察的標(biāo)本保存于4%的福爾馬林溶液中;用于DNA分析的材料在解剖鏡下挑除雜質(zhì)，用硅膠粉干燥貯存;憑證標(biāo)本保存于山西大學(xué)植物標(biāo)本館。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取

取一定量的干燥藻體于液氮中研磨，然后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，用SDS法提取基因組總DNA.

1.2.2 DNA 的電泳檢測

將提取的DNA產(chǎn)物進(jìn)行0.8% ～1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢定樣品DNA的完整性。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[15］，確定引物。正向引物t36F:5'-GTTAAYATTGGAACWATTGG-3'和反向引物t1070R:5'-CCATCATCAGCWGTRAATTG-3'.

擴(kuò)增反應(yīng)在美國BIO-RAD公司生產(chǎn)的PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體積為 25 μL，包括 1.0μL DNA 模板，2.5 μL引物 t36F，2.5 μL 引物 t1070R，2.0 μL 10 mmol/L dNTPs，2.5 μL 10 × buffer( 含 Mg2+)，14.3 μL ddH2O 及 0.2 μL Trans TaqTDNA 聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。擴(kuò)增程序?yàn)?95℃，10 min預(yù)變性。循環(huán)溫度94℃，1 min;52℃，1 min;72℃，1 min;35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸5 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶切割后參照DNA純化試劑盒使用說明進(jìn)行純化回收。

1.2.4 序列測定

序列測定由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2.5 獲得相關(guān)序列

從GenBank中獲得相關(guān)基因序列，登錄號(hào)見表1.

1.2.6 軟件分析

應(yīng)用Clustal X2.0將所測序列與GenBank中所得序列進(jìn)行比對(duì)[16］，人工檢查比對(duì)結(jié)果的正確性，并采用MEGA 4.0計(jì)算序列組成。構(gòu)建系統(tǒng)樹，其節(jié)點(diǎn)支持率使用1 000次自展(Bootstrap，BP)檢驗(yàn)。利用MrBayes3.0，Phyml3.0 和 PAUP*4.0b10 軟件分別重建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用貝葉斯法(Bayes)[17］、最大似然法(ML)和最大簡約法(MP)3種建樹方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

對(duì)tufA基因序列分析測得的片段長度為957 bp.tufA 堿 基 組 成 為 A34.6%，T30.1%，C15.0%，G20.3%.A+T 含量(64.7%)明顯大于C+8G含量(35.3%)，說明tufA基因在進(jìn)化上具有堿基偏好性。

表1 試驗(yàn)所用基因序列GenBank登錄號(hào)

2.2 系統(tǒng)樹發(fā)育分析

以較為原始的團(tuán)藻目中的Chlamydomonas reinhardtii和Volvox carteri為外類群，用貝葉斯法、最大似然法和最大簡約法分別計(jì)算得到Bayes樹，ML樹和MP樹，如圖1，圖2，圖3.圖中節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表1 000次重復(fù)(Botstrap，BP)分析得到的支持率(%)。

圖1 基于tufA基因的Bayes樹

比較圖1和圖2可知，Bayes樹和ML樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致?？梢钥闯?，泡狀饒氏藻與絲藻目的Ulothrix zonata親緣關(guān)系較近，但兩種方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹自展支持率較低，分別為52%和47%.另外，從系統(tǒng)樹位置上看，泡狀饒氏藻與鞘藻目(Oedogonia-les)的Oedogonium cardiacum和膠毛藻目的Draparnaldia plumosa也比較接近，而與石莼目的種類關(guān)系較遠(yuǎn)。MP樹(圖3)顯示的結(jié)果與前兩者略有不同，泡狀饒氏藻單獨(dú)稱為一支，但仍與鞘藻目、膠毛藻目的種類較為接近。

圖2 基于tufA基因的ML樹

圖3 基于tufA基因的MP樹

3 結(jié)論與討論

對(duì)于饒氏藻科分類系統(tǒng)的研究，以往都是從形態(tài)和解剖方面分析探討的。Papenfuss和石登紅等根據(jù)饒氏藻科植物體不具分枝及植物體呈假薄壁組織狀的形態(tài)特征，認(rèn)為與絲藻目植物不具分枝的絲狀體或膜狀體相似[8-14］，但二者在藻體大小及復(fù)雜程度上相差甚遠(yuǎn)。Printz主張將饒氏藻科列入膠毛藻目[6］，雖然該目植物體結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，但其具有異絲體性分枝的特征似也與饒氏藻科有很大的不同。Silva則認(rèn)為饒氏藻科尚未獲得廣泛承認(rèn)，應(yīng)將其放在一個(gè)分類很不穩(wěn)定的Ctenocladales中[7］。王模善等從饒氏藻科的藻體形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)入手，認(rèn)為將其歸于石莼目更合適[9］，但筆者的試驗(yàn)結(jié)果卻不支持這個(gè)觀點(diǎn)。筆者對(duì)泡狀饒氏藻的tufA基因進(jìn)行分析，顯示其與絲藻目、鞘藻目和膠毛藻目有一定關(guān)系，但未獲得較高的支持率。鑒于目前tufA基因用于藻類系統(tǒng)發(fā)育的研究報(bào)道較少，涉及到的種類較有限，有必要進(jìn)行更多的基因序列分析，并將傳統(tǒng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法科學(xué)地結(jié)合起來，才可能對(duì)饒氏藻科的分類地位得到更全面、客觀的結(jié)論。本試驗(yàn)結(jié)果也為tufA基因用于藻類植物系統(tǒng)發(fā)育研究的可行性提供了證據(jù)。

[1]Jao C C.Coelodiscus bullatus，sp.nov，a second species of the Coelodiscacea[J］.Botanical Bulletin Academia Sinica，1947(1):255-256.

[2]Jao C C.Studies on the freshwater algae of China.IX.Coelodiscaceae，a new family of the Chlorophyceae[J］.Sinensia，1941(12):291-298.

[3]Baillon M H.Etudes generals du groupe des Euphorbiacées[M］.Paris:Librairie de Victor Masson，1858.

[4]樊恭矩.綠藻綱的一個(gè)新科名和新屬名[J］.植物分類學(xué)報(bào)，1964，9(1):101.

[5]黎尚豪，畢列爵.中國淡水藻志[M］.北京:科學(xué)出版社，1998.

[6]Printz H.Die Chaetophoralen der Binnengew?sser.Eine systematische übersicht[J］.Hydrobiologia，1964，24(1):1-376.

[7]Silva P C.Chlorophycota.In:Parker S P，ed.Synopsis and classification of living organism [C］.New York:SP，McGraw-Hill，1982.133-161.

[8]Papenfuss G F.Classification of the algae.In:A century progress in the natural sciences 1 853-1 953[C］.San Francisco:California Academy of Sciences，1955，155-244.

[9]王模善，宿文瞳，王曉明.泡狀饒氏藻營養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究[J］.植物學(xué)報(bào)，1988，30(2):129-133.

[10]胡鴻鈞，魏印心.中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類及生態(tài)[M］.北京:科學(xué)出版社，2006.

[11]何培民，張榮銑.藻類葉綠體DNA和基因圖譜[J］.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，9(1):51-58.

[12]Gary W，Kucera H.An evaluation of rbcL，tufA，UPA，LSU and ITS as DNA barcode markers for the marine green macroalgae[J］.Cryptogamie，Algologie，2010，31(4):487-528.

[13]李紅麗，胡鴻鈞.饒氏藻顯微結(jié)構(gòu)及泡狀饒氏藻超微結(jié)構(gòu)研究[J］.武漢植物學(xué)研究，2003，21(6):481-486.

[14]石登紅，陳 椽，陳 訓(xùn).饒氏藻屬(Jaoa)的形態(tài)學(xué)初步研究[J］.貴州科學(xué)，2004，22(3):89-91.

[15]Yoon H S，Hackett J D，Pinto G，et al.The single，ancient origin of chromist plastids[J］.PNAS，2002，99:15 507-15 512.

[16]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J］.Journal of Nucleic Acid Research，1997，25(24):4 876-4 882.

[17]Ronquist F，Huelsenbeck J P.MrBayes 3:Bayesian phylogenetic inference under mixed models[J］.Journal of Bioinformatics，2003，19(12):1 572-1 574.