隋 娟, 徐世宏, 王文琪, 馬道遠(yuǎn), 肖志忠, 肖永雙, 劉清華, 李 軍

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 青島 266109)

牙鲆與夏鲆雜交及回交子代胚胎發(fā)育及早期生長(zhǎng)比較

隋 娟1, 徐世宏1, 王文琪2, 馬道遠(yuǎn)1, 肖志忠1, 肖永雙1, 劉清華1, 李 軍1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 青島 266109)

通過(guò)人工授精技術(shù)對(duì)牙鲆(Paralichthys olivaceus )和夏鲆( Paralichthys dentatus )進(jìn)行了正反交及回交實(shí)驗(yàn), 并比較了正反交、回交子代的胚胎發(fā)育時(shí)序和仔稚幼魚(yú)的生長(zhǎng)。結(jié)果表明： 孵化水溫18.0±0.5℃下, 初孵仔魚(yú)破膜用時(shí)為： 牙鲆41 h, 正交鲆 47 h, 回交牙鲆42 h30 min, 回交夏鲆 44 h;16.5±0.5℃下, 夏鲆61 h 40 min, 反交鲆66 h。正交及兩組回交子代在胚胎期均可正常發(fā)育。反交子代卵裂期出現(xiàn)異常, 僅少數(shù)胚胎可以孵化。胚胎孵化后, 在1～64日的培養(yǎng)過(guò)程中, 反交鲆于3～4 d內(nèi)全部死亡, 回交牙鲆發(fā)育至18日齡時(shí)全部死亡。正交鲆和回交夏鲆可正常發(fā)育, 與牙鲆沒(méi)有明顯差別。

牙鲆(Paralichthys olivaceus); 夏鲆(Paralichthys dentatus); 雜交; 回交; 早期發(fā)育

雜交育種不僅可以對(duì)現(xiàn)有品種加入更優(yōu)良的新的遺傳性狀, 也可以使兩種或兩種以上具有不同優(yōu)良特性的類型結(jié)合而成更加優(yōu)秀的新類型, 是魚(yú)類育種的基本手段之一[1]。雜種一代除了一些比較優(yōu)良的類型可直接利用外, 還可以進(jìn)行雜種與某一親本間的回交。回交是雜交育種的重要手段之一, 旨在通過(guò)雜交種與雙親之一再次雜交, 使后代加強(qiáng)輪回親本的某些優(yōu)良性狀, 減少雜種后代的分離, 并保留非輪回親本的少數(shù)優(yōu)良性狀[2]。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)與夏鲆(Paralichthys dentatus)均屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、鰈亞目(Pleuronectoidei)、鲆科(Bothidae)、牙鲆屬(Paralichthys)。牙鲆主要分布于中國(guó)東部沿海以及朝鮮、日本、俄國(guó)遠(yuǎn)東沿岸海區(qū), 在中國(guó)、韓國(guó)、日本均有大規(guī)模養(yǎng)殖, 是優(yōu)良的海水養(yǎng)殖種之一。夏鲆又稱夏牙鲆、大西洋牙鲆、犬齒牙鲆等, 主要分布于北美洲大西洋沿岸, 于2002年引入中國(guó)。與牙鲆相比,夏鲆耐高溫, 但越冬死亡率高, 而牙鲆渡夏困難, 能安全越冬。為培育出生長(zhǎng)快、適溫范圍廣的養(yǎng)殖新品種, 本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)人工授精的方法對(duì)牙鲆和夏鲆進(jìn)行雜交試驗(yàn)并獲得了雜種 F1代, 利用 F1(♀)分別同牙鲆(♂)和夏鲆(♂)回交, 獲得了兩組回交子代。

目前, 國(guó)內(nèi)許多學(xué)者已對(duì)牙鲆和夏鲆雜交進(jìn)行了研究, 研究?jī)?nèi)容主要集中在牙鲆♀ × 夏鲆♂雜種早期發(fā)育、遺傳特征以及雜種優(yōu)勢(shì)[3-7], 而對(duì)正反交及回交的胚胎發(fā)育比較以及仔稚幼魚(yú)生長(zhǎng)比較目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此, 本研究以牙鲆和夏鲆正反交子代以及兩組回交子代為研究對(duì)象, 系統(tǒng)比較了正反交子代、回交子代及親本的胚胎發(fā)育時(shí)序以及仔稚幼魚(yú)的生長(zhǎng), 以期為鲆鰈類養(yǎng)殖新品種的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)及配子采集

牙鲆和夏鲆的雜交及回交實(shí)驗(yàn)在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生物技術(shù)工程研究發(fā)展中心進(jìn)行。夏鲆親魚(yú)為2002年從美國(guó)引進(jìn)的魚(yú)苗, 經(jīng)過(guò)人工培育而成。牙鲆為青島本地養(yǎng)殖種。雌性雜交鲆來(lái)自2005年在青島連三島養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行的牙鲆(♀)與夏鲆(♂)雜交實(shí)驗(yàn)。共有5尾雌牙鲆, 10尾雄牙鲆, 2尾雌夏鲆,10尾雄夏鲆及2尾雌雜交鲆作為親魚(yú)用于本研究。用于繁殖的雌魚(yú)(牙鲆、正交鲆)為3齡魚(yú), 體質(zhì)量2～4 kg; 雄魚(yú)(夏鲆)為2齡魚(yú), 體質(zhì)量1～2 kg。親魚(yú)經(jīng)人工誘導(dǎo)性成熟后采用人工擠壓腹部的方法采集精液和卵子。顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況, 僅運(yùn)動(dòng)率高于90%的精子用于實(shí)驗(yàn), 與質(zhì)量好的卵子(規(guī)則圓形,顏色為半透明微黃色)通過(guò)干法授精獲得受精卵。等受精卵充分上浮后, 過(guò)濾并洗卵數(shù)次。共得到6組組合, 包括：

兩組親本組合： 牙鲆♀ × 牙鲆♂ (牙鲆)

夏鲆♀ × 夏鲆♂(夏鲆)

兩組雜交組合： 牙鲆♀ × 夏鲆♂(F1)(正交)

牙鲆♂× 夏鲆♀(反交)

兩組回交組合： 正交 F1♀ ×牙鲆♂ (回交牙鲆)

正交 F1♀ ×夏鲆♂(回交夏鲆)

1.2 受精卵培育及觀察

由于各組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間不同, 因此受精卵培育水溫有所差別。牙鲆、正交鲆及兩組回交鲆培育水溫為 18.0±0.5℃, 夏鲆及反交鲆培育水溫為16.5±0.5℃。鹽度 32～33, pH 7.8～8.2。每組取 500粒卵于500 mL燒杯中靜水孵化, 設(shè)3個(gè)平行樣。孵化及培養(yǎng)用海水預(yù)先在養(yǎng)殖池內(nèi)進(jìn)行加熱, 將燒杯懸浮于養(yǎng)殖池大水體中以保持孵化水溫恒定。培育期間定期取樣, 在 Nikon YS-100型顯微鏡下觀察各組合胚胎發(fā)育時(shí)序并記錄。各組剩余受精卵分別放入160 L圓柱形培養(yǎng)缸內(nèi)進(jìn)行培育, 微充氣。

1.3 正交、回交子代與牙鲆仔稚幼魚(yú)的培育及數(shù)據(jù)測(cè)量

初孵仔魚(yú)的培育水溫為 19±0.5℃, 隨仔魚(yú)發(fā)育緩慢升高至20±0.5℃, 保持此溫度進(jìn)行培育。破膜仔魚(yú)開(kāi)口后采用經(jīng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的褶皺臂尾輪蟲(chóng)(Branchionou plicatilis)、鹵蟲(chóng)(Artemiaspp.)無(wú)節(jié)幼體、橈足類及其幼體和魚(yú)蝦肉糜作為仔稚幼魚(yú)的餌料系列。在仔稚幼魚(yú)培育期間(1～64日齡), 每天固定時(shí)間取樣, 每次隨機(jī)采集 10尾, 用 100 mg/L的MS-222麻醉后在解剖鏡下測(cè)定各組仔稚幼魚(yú)全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高和肛前長(zhǎng)等形態(tài)學(xué)特征, 用5%的福爾馬林進(jìn)行固定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)量所得各組生長(zhǎng)數(shù)據(jù)用 excel 2003處理,SPSS16.0軟件分析每組魚(yú)的生長(zhǎng)情況,P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 6組組合胚胎發(fā)育

正交子代及兩組回交子代的胚胎發(fā)育規(guī)律與雙親的發(fā)育規(guī)律基本一致。反交子代在分裂期出現(xiàn)大量畸形, 僅有少部分卵子能通過(guò)原腸期繼續(xù)發(fā)育。在孵化水溫18.0±0.5℃下, 初孵仔魚(yú)破膜用時(shí)為： 牙鲆41 h, 正交鲆47 h, 回交牙鲆42 h30 min, 回交夏鲆44 h。孵化水溫16.5±0.5℃下, 夏鲆61 h40 min, 反交鲆66 h, 具體發(fā)育時(shí)間和發(fā)育階段見(jiàn)表1。

2.2 正反交及回交組合與牙鲆的早期生長(zhǎng)比較

正反交及兩組回交組合的仔魚(yú)均可孵化, 但反交鲆孵化后身體畸形, 開(kāi)口前全部死亡(圖 1)?；亟谎丽覐?～15日齡可正常生長(zhǎng), 從15日齡開(kāi)始, 直至18日齡生長(zhǎng)明顯緩慢(P＜0.05), 并最終死亡。

作者對(duì)正交鲆、回交夏鲆的仔稚幼魚(yú)生長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量并與牙鲆作了比較(圖2)。初孵仔魚(yú)經(jīng)過(guò)64 d的生長(zhǎng), 正交鲆平均全長(zhǎng)達(dá)到19.28 cm, 體長(zhǎng)16.17 cm,體高7.62 cm, 肛前長(zhǎng)6.54 cm; 回交夏鲆全長(zhǎng)21.35 cm, 體長(zhǎng)17.54 cm, 體高8.04 cm, 肛前長(zhǎng)6.80 cm;牙鲆平均全長(zhǎng) 21.87 cm, 體長(zhǎng) 19.11 cm, 體高 8.97 cm, 肛前長(zhǎng)8.38 cm。直至64日齡, 3個(gè)組合的生長(zhǎng)情況并未見(jiàn)明顯差別(P＞0.05)。

表1 牙鲆與夏鲆雜交及回交胚胎發(fā)育時(shí)序的比較Tab. 1 Time-table of embryonic developments of reciprocal hybrids and backcrosses of P. olivaceus and P. dentatus

圖1 6個(gè)組合的初孵仔魚(yú)Fig. 1 Newly hatched larvae of six groups1-1. 牙鲆; 1-2. 夏鲆; 1-3. 正交鲆; 1-4. 反交鲆; 1-5.回交牙鲆;1-6. 回交夏鲆1-1. P. olivaceus; 1-2. P. dentatus; 1-3. F1; 1-4. P. dentatus(♀) ×P. olivaceus(♂); 1-5. F1(♀) × P. olivaceus(♂); 1-6. F1(♀) ×P. dentatus (♂); F1. P. olivaceus(♀) × P. dentatus(♂)

正交鲆, 回交夏鲆及牙鲆的全長(zhǎng)與體長(zhǎng)增幅比較平穩(wěn), 從初孵仔魚(yú)到64日齡平均日增長(zhǎng)率分別為27.20%和23.26%。體高和肛前長(zhǎng)的增長(zhǎng)明顯分為3個(gè)階段, 體高的變化從初孵仔魚(yú)到22日齡為緩慢增長(zhǎng)期,平均增長(zhǎng)率為6.17%; 22～28日齡為快速增長(zhǎng)期, 平均增長(zhǎng)率為62.17%; 28～64日齡漲幅變慢, 平均增長(zhǎng)率為7.57%。肛前長(zhǎng)從初孵仔魚(yú)到22日齡為緩慢增長(zhǎng)期, 平均增長(zhǎng)率為8.67%, 22～28日齡為快速增長(zhǎng)期, 平均增長(zhǎng)率為 44.44%, 28～64日齡漲幅變慢, 平均增長(zhǎng)率為3.80%。體長(zhǎng)/體高經(jīng)歷了先緩慢下降, 再快速下降, 再趨向平穩(wěn)的過(guò)程。第一個(gè)拐點(diǎn)出現(xiàn)在19 d(全長(zhǎng)/體高均值為5.6), 表明19 d之前體高比體長(zhǎng)生長(zhǎng)稍快, 而后體高生長(zhǎng)迅速加快, 26 d前后是全長(zhǎng)/體高的第二個(gè)拐點(diǎn)(均值 1.95), 此后全長(zhǎng)/體高相對(duì)穩(wěn)定。體長(zhǎng)/肛前長(zhǎng)經(jīng)歷了平穩(wěn)期, 快速下降以及緩慢上升3個(gè)階段。第一個(gè)拐點(diǎn)出現(xiàn)在22 d(體長(zhǎng)/肛前長(zhǎng)均值為2.59), 表明22 d以前體長(zhǎng)與肛前長(zhǎng)增長(zhǎng)速度一致, 之后肛前長(zhǎng)生長(zhǎng)速度加快, 26 d前后為體長(zhǎng)/肛前長(zhǎng)的第二個(gè)拐點(diǎn)(均值1.75), 此后體長(zhǎng)/肛前長(zhǎng)緩慢增長(zhǎng), 表明26天后肛門(mén)后的軀干部生長(zhǎng)開(kāi)始加快。

圖2 牙鲆、正交鲆、回交牙鲆、回交夏鲆的早期生長(zhǎng)Fig. 2 Early development of P. olivaceus, F1, F1(♀) × P. olivaceus(♂), F1(♀) × P. dentatus (♂)

3 討論

3.1 正反交及回交子代與親本胚胎發(fā)育比較

正反交及兩組回交的胚胎發(fā)育所經(jīng)歷的發(fā)育過(guò)程與其他牙鲆屬的種基本相同, 經(jīng)歷卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官發(fā)生期和孵化出膜期 7個(gè)主要發(fā)育時(shí)期, 在發(fā)育過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的特異性。

大多數(shù)魚(yú)類的胚胎發(fā)育都比較復(fù)雜, 其細(xì)胞增殖和分化同時(shí)出現(xiàn), 但會(huì)以不同的速度進(jìn)行[9]。在于道德[3]等的研究中提到正交鲆的的胚胎發(fā)育時(shí)間與父本牙鲆孵化時(shí)間相近, 在 15.4～16.0℃下, 雜交鲆孵化需76 h, 牙鲆為64 h, 夏鲆為77 h[11], 并非簡(jiǎn)單介于父母本之間。該遺傳現(xiàn)象在弓斑東方(Fugu ocellatus)與暗紋東方(Fugu obscurus)的雜交中也有過(guò)類似報(bào)道[12]。在 18.6～21.5℃下, 雜交東方孵化需144 h50 min, 母本弓斑東方需169 h30 min,父本暗紋東方需139 h10 min。然而, 亦有大量雜交胚胎的孵化時(shí)間偏向母本, 如金魚(yú)(Carassius auratus)與大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)的雜交[13],狀皇姑魚(yú)(Nibea miichthtoides)與大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)的雜交[14]等。

遺憾的是, 本研究中由于親魚(yú)成熟時(shí)間前后有一定差異, 完全控制在同一時(shí)間段產(chǎn)卵十分困難, 6組交配試驗(yàn)分為兩次完成。雖然 6組組合的胚胎發(fā)育所處溫度并不完全一致, 但同在18.0±0.5℃下, 所得的回交牙鲆分別與其母本雜交鲆和父本牙鲆的胚胎發(fā)育時(shí)間相比, 孵化時(shí)間與其父本牙鲆相近。雜交魚(yú)胚胎孵化時(shí)間的這種偏父或偏母現(xiàn)象是受遺傳影響還是環(huán)境影響仍需進(jìn)一步研究。

3.2 早期發(fā)育過(guò)程中的雜種優(yōu)勢(shì)

在本研究中, 1～64日齡的正交鲆與回交夏鲆在生長(zhǎng)速度上并未出現(xiàn)明顯的雜種優(yōu)勢(shì), 正交鲆工廠化養(yǎng)殖中所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)快的特點(diǎn)(未發(fā)表)在發(fā)育早期并沒(méi)有體現(xiàn)。在野生與馴化的虹鱒魚(yú)之間的雜交及回交研究中也報(bào)到過(guò)類似現(xiàn)象[8]。作者推測(cè)這可能與雜種優(yōu)勢(shì)的延遲表達(dá)有關(guān)。雜種優(yōu)勢(shì)源自于兩套在遺傳上有一定距離且能相容的基因組在受精時(shí)的融合, 來(lái)自父親的一套基因組被激活標(biāo)志著發(fā)育過(guò)程中合子由母源性表達(dá)開(kāi)始向合子表達(dá)過(guò)渡[15]。而在擬南芥(Arabidopsis spp.)[16]、玉米(Zea mays)[17]、小鼠(Mus spp.)[18]等生物中發(fā)現(xiàn)父本基因組存在某種程度的延遲表達(dá)現(xiàn)象, 使得這些雜交子代在發(fā)育早期不能表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象。因此, 正交鲆或回交夏鲆發(fā)育早期在生長(zhǎng)上沒(méi)有明顯雜種優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象有可能與父本基因組的延遲表達(dá)有關(guān)。當(dāng)然, 養(yǎng)殖室內(nèi)的培養(yǎng)條件也可能并非正交鲆與回交夏鲆的最適生長(zhǎng)條件。要解釋這一問(wèn)題需要對(duì)等位基因在受精后的表達(dá)進(jìn)行追蹤以及對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化。

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Comparison of embryonic development and growth of hybrids and backcrosses from Paralichthys olivaceus and Paralichthys dentatus

SUI Juan1, XU Shi-hong1, WANG Wen-qi2, MA Dao-yuan1, XIAO Zhi-zhong1,XIAO Yong-shuang1, LIU Qing-hua1, LI Jun1
(1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Qingdao Agricultural University, Institute of animal science and technology, Qingdao 266109, China)

Nov., 12, 2010

Paralichthys olivaceus; Paralichthys dentatus; hybridization; backcross; early development

Reciprocal and back crosses were carried out on Paralichthys olivaceus (Po) and Paralichthys dentatus(Pd) by artificial fertilization. The embryonic and larvae development were compared among the six groups. The results showed that, at 18.0℃±0.5℃, the embryos of P. olivaceus, Po(♀) × Pd(♂), F1(♀) × Po(♂) and F1(♀) ×Pd(♂)took 41, 47, 42.5, and 44 h to hatch, respectively. At 16.5℃±0.5℃, the embryos of P. dentatus and Pd (♀) ×Po (♂)took 61 h 40 min and 66 h to hatch, respectively. For Po(♀) × Pd(♂) and two back crosses, the embryos developed normally. While most of the embryos from Pd (♀) ×Po (♂) developed with abnormal cleveage, only few embryos hatched out normally. During a 64-day cultivation of the post hatching larvae, all hybrids of Pd(♀) ×Po (♂) died at 3-4 days post hatching (dph) and F1(♀) × Po(♂) offspring died completely at 18 dph. The progenies of Po(♀) ×Pd(♂) and F1(♀) × Pd(♂) experienced normal development and growth stages as that of P. olivaceus.

S917

A

1000-3096(2012)06-0054-05

2010-11-12;

2011-01-11

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(nycytx-50); 國(guó)家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金(2009GB24910539); 中國(guó)科學(xué)院知識(shí)創(chuàng)新項(xiàng)目

(KSCX2-EW-B-3); 山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011GHy11530); 山東省中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2009HZ007); 青島市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(09-1-3 -11-jch)

隋娟(1984-), 女, 山東淄博人, 博士研究生, 主要從事海洋動(dòng)物遺傳育種研究, E-mail： suijuan0313@yahoo.com.cn; 李軍, 通信作者, E-mail：junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, E-mail： qinghualiu@qdio.ac.cn

(本文編輯：譚雪靜)