劉 勇，高 娜，李志剛，朱 靈，李 飛，張 龍

（中國(guó)科學(xué)院安徽光學(xué)精密機(jī)械研究所光電子技術(shù)研究室，安徽合肥 230031）

0 引言

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的技術(shù)。它具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，在分子生物學(xué)和基因工程實(shí)驗(yàn)室、疾病檢測(cè)、臨床應(yīng)用、商品檢疫、新醫(yī)藥開發(fā)和工農(nóng)業(yè)制品等方面顯示了巨大潛力和廣泛用途［1］。微流控PCR是在微流控芯片上加工的微反應(yīng)室中進(jìn)行PCR，利用芯片體積小、比表面積大和集成度高等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)芯片上的DNA快速擴(kuò)增，具有耗樣少、擴(kuò)增效率高、速度快和可集成等優(yōu)勢(shì)，在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛研究和商業(yè)化應(yīng)用［2］。

PCR由高溫變性、低溫退火和適溫延伸組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的基因片段得以迅速擴(kuò)增。其中，溫度控制的精度非常重要，直接影響PCR實(shí)驗(yàn)成功與否，較大的溫度偏差會(huì)導(dǎo)致PCR實(shí)驗(yàn)失敗［3］。近年來研究表明［4］，提高PCR熱循環(huán)中3個(gè)溫區(qū)之間的升降溫速率，不僅能夠縮短整個(gè)PCR擴(kuò)增過程所需時(shí)間，而且特異性更好。因此，PCR反應(yīng)中的溫度控制不僅涉及升溫、降溫和恒溫過程，還要求溫度控制精度高，超調(diào)小，調(diào)節(jié)時(shí)間短。在溫度控制中，微流控芯片周圍環(huán)境溫度也會(huì)對(duì)其造成干擾，因此，這種溫度控制具有時(shí)變、非線性等不利因素。如果采用傳統(tǒng)的PID算法，控制參數(shù)選擇較困難，系統(tǒng)存在抗干擾能力差、超調(diào)量大等缺點(diǎn)［5，6］。

本文采用系統(tǒng)辨識(shí)的方法建立了被控對(duì)象的數(shù)學(xué)模型，利用前饋控制對(duì)周圍環(huán)境溫度進(jìn)行補(bǔ)償，并根據(jù)所建模型的動(dòng)態(tài)特性提出了超前校正的控制方法，在實(shí)際系統(tǒng)調(diào)試中，又根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)的條件采用了分段控制，成功實(shí)現(xiàn)了快速升降溫和精確控溫。

1 溫度控制系統(tǒng)的構(gòu)成

溫度控制結(jié)構(gòu)如圖1，溫度控制系統(tǒng)框圖如圖2所示，主要由以下幾部分組成:溫度信號(hào)檢測(cè)與輸入、控制器、執(zhí)行機(jī)構(gòu)和微流控芯片。采用Pt100熱敏電阻器測(cè)溫［7］，利用恒壓驅(qū)動(dòng)方式將Pt100隨溫度的阻值變化轉(zhuǎn)換成電壓信號(hào)，放大后經(jīng)過16位A/D轉(zhuǎn)換器MX7705將數(shù)字信號(hào)反饋到輸入端，和設(shè)定溫度值比較?？刂破鞲鶕?jù)溫度誤差e調(diào)節(jié)超前校正和積分環(huán)節(jié)的控制參數(shù)，輸出可變占空比的PWM信號(hào)至執(zhí)行機(jī)構(gòu)。溫度控制的執(zhí)行器采用了半導(dǎo)體制冷片，半導(dǎo)體制冷片既能實(shí)現(xiàn)加熱，又能實(shí)現(xiàn)制冷，通過輸入電流的控制可實(shí)現(xiàn)高精度的溫度控制［8］。輸出信號(hào)經(jīng)過驅(qū)動(dòng)電路實(shí)現(xiàn)半導(dǎo)體制冷片加熱或制冷，從而使微流控芯片PCR反應(yīng)室溫度達(dá)到所設(shè)定的溫度值。

圖1 溫度控制結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Schematic diagram of temperature control structure

圖2 溫度控制系統(tǒng)框圖Fig 2 Block diagram of temperature control system

2 溫度控制器實(shí)現(xiàn)

對(duì)于微流控PCR溫度控制系統(tǒng)，采用系統(tǒng)辨識(shí)的方法建立了被控對(duì)象的數(shù)學(xué)模型，其傳遞函數(shù)為G（s）=7．5/s（0．7s+1）4。由于系統(tǒng)受周圍環(huán)境溫度的影響，會(huì)損失部分熱量，使溫度降低，利用前饋控制對(duì)其進(jìn)行了溫度補(bǔ)償

其中，Tsetpoint為設(shè)定溫度，Tambient為周圍環(huán)境溫度，Kc為補(bǔ)償因子。通過前饋控制輸出一個(gè)附加量，補(bǔ)償了損失的熱量，提高系統(tǒng)對(duì)周圍環(huán)境的抗干擾能力。

2．1 超前校正設(shè)計(jì)

對(duì)所建模型進(jìn)行開環(huán)頻率分析，發(fā)現(xiàn)其相位裕量為負(fù)值，要使最小相位系統(tǒng)穩(wěn)定，相位裕量必須為正值，故設(shè)計(jì)了超前校正控制器。超前校正的傳遞函數(shù)［9］為

式中 α稱為分度系數(shù)，T為時(shí)間常數(shù)。超前校正具有正的相角特性，能提供的最大正相角為

根據(jù)穩(wěn)態(tài)誤差確定系統(tǒng)增益K，繪制未校正系統(tǒng)的對(duì)數(shù)頻率特性，確定出未校正系統(tǒng)的相位裕量。根據(jù)關(guān)系式（4）確定超前校正提供的最大正相角

2．2 分段控制設(shè)計(jì)

實(shí)際使用過程中發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)時(shí)溫度存在誤差，增加積分環(huán)節(jié)可以改善系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)性能，減小穩(wěn)態(tài)誤差。但是當(dāng)選用較大的積分因子時(shí)，系統(tǒng)易出現(xiàn)超調(diào)和振蕩;而選用較小的積分因子時(shí)，系統(tǒng)基本無超調(diào)，但是調(diào)整時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致升降溫速率較慢。因此，采用積分—超前校正算法很難同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速升降溫和精確控溫。

為了實(shí)現(xiàn)快速升降溫和精確的控溫，提出了分段控制，設(shè)置一個(gè)誤差閾值β，根據(jù)溫度誤差e大小采用不同的控制參數(shù)，其規(guī)則如下:

1）當(dāng)|e|＞β時(shí)，為使系統(tǒng)具有較好的動(dòng)態(tài)特性，提高系統(tǒng)響應(yīng)速度，縮短調(diào)整時(shí)間，選取較大的增益;同時(shí)為避免系統(tǒng)響應(yīng)出現(xiàn)較大超調(diào)，積分因子為0。

2）當(dāng)|e|≤β時(shí)，為使系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性，避免引起振蕩，減小增益;同時(shí)為了減小穩(wěn)態(tài)誤差，增加積分環(huán)節(jié)，選擇合適的積分因子。

分段控制使參數(shù)調(diào)節(jié)更靈活，不僅發(fā)揮了積分環(huán)節(jié)和增益的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還避免了引起系統(tǒng)不穩(wěn)定。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別采用積分—超前校正算法和分段控制算法對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)試，圖3的曲線是系統(tǒng)從72℃升溫到95℃的數(shù)據(jù)，圖4的曲線是系統(tǒng)從95℃降溫到60℃的數(shù)據(jù)。由圖中可以看出:采用積分—超前校正算法時(shí)穩(wěn)態(tài)誤差較小，但是系統(tǒng)調(diào)整時(shí)間較長(zhǎng)，升降溫速率較慢;采用分段控制算法時(shí)，系統(tǒng)調(diào)整時(shí)間變短，平均升溫速率4．46℃/s，平均降溫速率4．36℃/s，同時(shí)又保持了較小的穩(wěn)態(tài)誤差，穩(wěn)態(tài)誤差不大于0．5℃。

將系統(tǒng)用于微流控PCR實(shí)驗(yàn)。圖5是系統(tǒng)實(shí)際的溫度控制過程中部分周期的溫度循環(huán)曲線，其中，變性階段95℃持續(xù)10 s，退火階段53℃持續(xù)15s，延伸階段72℃持續(xù)20s，一個(gè)溫控循環(huán)用時(shí)60s，升降溫速率較快，超調(diào)很小，完全可以滿足微流控PCR實(shí)驗(yàn)的需求。

4 結(jié)論

圖3 升溫曲線Fig 3 Heating curve

圖4 降溫曲線Fig 4 Cooling curve

圖5 PCR溫度循環(huán)曲線Fig 5 PCR temperature cycling curves

根據(jù)微流控PCR快速升降溫、精確控溫的要求，設(shè)計(jì)了一種分段式超前校正控制器，使系統(tǒng)不僅具有較好的動(dòng)態(tài)特性，還具有較好的穩(wěn)態(tài)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:分段控制算法能夠靈活的調(diào)整參數(shù)，具有較好的控制品質(zhì)，不僅縮短了系統(tǒng)調(diào)整時(shí)間，取得較好的升降溫速率，還保持了較小的穩(wěn)態(tài)誤差。目前，集成該算法的溫控系統(tǒng)已滿足微流控PCR實(shí)驗(yàn)的需求，計(jì)劃用于致病菌PCR實(shí)驗(yàn)。

［1］ 陳文元，張衛(wèi)平．集成微流控聚合物PCR芯片［M］．上海:上海交通大學(xué)出版社，2009:29－34．

［2］ 姚李英，陳濤，王升啟，等．高聚物基PCR微流控芯片技術(shù)［J］．中國(guó)生物工程雜志，2004，24（3）:90 －93．

［3］ 馬建崗．基因工程學(xué)原理［M］．2版．西安:西安交通大學(xué)出版社，2007:82－96．

［4］ Wittwer C T，Garling D J．Rapid cycle DNA amplication:Time and temperature optimization［J］．BioTechniques，1991，10（1）:76－83．

［5］ 畢雪芹，倪 原，王麗娟．PCR溫度模糊PID控制器的設(shè)計(jì)與仿真［J］．計(jì)算機(jī)工程與設(shè)計(jì)，2008，29（10）:2604 －2606．

［6］ 邱憲波，袁景淇．帶前饋補(bǔ)償?shù)幕驍U(kuò)增反應(yīng)高精度溫控系統(tǒng)［J］．儀器儀表學(xué)報(bào)，2005，26（8）:831 －832．

［7］ 松井邦彥．傳感器應(yīng)用技巧141例［M］．梁瑞林，譯．北京:科學(xué)出版社，2006:77 －92．

［8］ 陳振林，孫中泉．半導(dǎo)體制冷器原理與應(yīng)用［J］．微電子技術(shù)，1999，27（5）:63 －65．

［9］ 龐國(guó)仲，自動(dòng)控制原理［M］．合肥:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社，2007:322－326．