侯長(zhǎng)軍，宋 坤，彭 劍，霍丹群，董家樂(lè)，黃承洪

（重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400030）

0 引言

目前，在全世界范圍內(nèi)肺癌都是最常見(jiàn)的腫瘤之一，而且其發(fā)病致死率位居所有腫瘤的首位，極大地威脅著人類(lèi)的生命健康。但是肺癌往往起病隱匿，患者被確診時(shí)一般已為晚期，失去了最佳的治療時(shí)機(jī)。為了克服這一問(wèn)題，現(xiàn)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)了可以實(shí)現(xiàn)多種模式的早期診斷的方法，比如:影像學(xué)檢查、支氣管內(nèi)鏡檢查，以及對(duì)各種肺癌標(biāo)志物的識(shí)別等。而在各種肺癌標(biāo)志物中，有染色體類(lèi)標(biāo)志物［1］、DNA 類(lèi)標(biāo)志物［2］、蛋白類(lèi)標(biāo)志物［3］、RNA 類(lèi)標(biāo)志物［4］以及呼出氣體類(lèi)標(biāo)志物［5～10］等。這些標(biāo)志物也都能在一定程度上實(shí)現(xiàn)肺癌患者與正常群體的區(qū)分判別。但是就其所采用的檢測(cè)方法的時(shí)效性、經(jīng)濟(jì)性、靈活性上都不能滿(mǎn)足診斷的需求，它們無(wú)不需要依靠一些大型儀器才能完成分析，限制了該類(lèi)診斷方法的推廣。

本文深入研究了一種不同于以往電子鼻技術(shù)的可視化傳感器陣列系統(tǒng)［11］。它是一種通過(guò)陣列芯片上各種敏感材料與待分析物之間各種不同的響應(yīng)機(jī)制，交叉組合綜合分析待研究物質(zhì)的傳感檢測(cè)技術(shù)，且對(duì)于具有相似結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分析物也有著非常優(yōu)異的識(shí)別效果。Phillips M等人曾先后篩選出來(lái)的一系列肺癌標(biāo)志物［8～10］，本文以此為標(biāo)準(zhǔn)，利用自行開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)出的專(zhuān)門(mén)針對(duì)肺癌標(biāo)志物的可視化傳感器陣列系統(tǒng)，研究探索了苯乙烯、1，2，4—三甲基苯、正丁烷、正戊烷這4種肺癌標(biāo)志物不同體積分?jǐn)?shù)梯度下的有效識(shí)別與區(qū)分，為后續(xù)肺癌標(biāo)志物標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立提供一定的支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑與儀器

4種肺癌標(biāo)志物（苯乙烯、1，2，4—三甲基苯、正丁烷、正戊烷）以及各種指示劑染料均為分析純（Sigma-Aldrich公司）;卟啉及其衍生物均為分析純（Frontier Scientific公司）;99．999%氮?dú)猓ㄖ貞c優(yōu)能火公司）;聚偏氟乙烯膜（Millipore公司）。配氣儀（實(shí)驗(yàn)室自行研發(fā)）;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Unico公司）。

1．2 氣體樣品制備

以篩選出來(lái)的4種肺癌標(biāo)志物為檢測(cè)對(duì)象，其中包括2種帶有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物（苯乙烯、1，2，4—三甲基苯）;2種直鏈烷烴類(lèi)標(biāo)志物（正丁烷、正戊烷）。4種標(biāo)志物分別用微量注射器吸取5 μL，注入配氣儀并配置成4種不同體積分?jǐn)?shù)梯度，具體梯度數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 肺癌標(biāo)志物及其體積分?jǐn)?shù)梯度Tab 1 Lung cancer markers and their volume fraction gradient

1．3 陣列芯片制備

陣列芯片由敏感物質(zhì)和芯片膜材兩部分組成，敏感物質(zhì)是經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選得出的。首先通過(guò)紫外—可見(jiàn)光譜分析標(biāo)志物與敏感物質(zhì)溶液作用前后的光譜學(xué)變化，初步選定有明顯響應(yīng)效果的敏感物質(zhì);然后將敏感物質(zhì)附載在所選膜材，實(shí)驗(yàn)時(shí)須進(jìn)行固—?dú)庀嘧饔脤?shí)驗(yàn)，篩選出作用效果理想的敏感物質(zhì)。通過(guò)前期研究篩選出36種針對(duì)肺癌標(biāo)志物具有不同光譜響應(yīng)的敏感物質(zhì)，構(gòu)建成6×6的傳感器陣列。這些敏感物質(zhì)主要包括各種卟啉及其衍生物和指示劑染料。芯片膜材選用聚偏氟乙烯膜（PVDF）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

肺癌標(biāo)志物氣體與陣列芯片間相互作用在一個(gè)密封獨(dú)立空間內(nèi)進(jìn)行，所有反應(yīng)均以高純N2為背景氣體。通過(guò)調(diào)整N2與肺癌標(biāo)志物氣體之間比例實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)志物體積分?jǐn)?shù)的控制。依靠密閉空間內(nèi)的恒溫裝置可將溫度控制在36～38℃范圍內(nèi)，與人體呼出氣體溫度保持一致。該可視化傳感器陣列檢測(cè)系統(tǒng)工作原理如圖所示（見(jiàn)圖1）。

圖1 可視化傳感器陣列檢測(cè)系統(tǒng)原理圖Fig 1 Detecting principle diagram of colorimetric sensor array

數(shù)據(jù)信號(hào)的采集和處理系統(tǒng)是本實(shí)驗(yàn)室自行開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的，其原理首先是通過(guò)高質(zhì)量圖像傳感器對(duì)芯片反應(yīng)前、后陣列的光譜圖采集。然后系統(tǒng)會(huì)對(duì)反應(yīng)前后的光譜圖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，提取每個(gè)反應(yīng)點(diǎn)中有價(jià)值R，G，B信號(hào)并保存。根據(jù)這些信號(hào)的變化可以得到反應(yīng)前后各點(diǎn)R，G，B的變化值及其整體芯片的差譜圖。R，G，B的變化值詳細(xì)體現(xiàn)了反應(yīng)過(guò)程各個(gè)點(diǎn)的具體變化，而整個(gè)陣列的差譜圖則是對(duì)特定標(biāo)志物分子與陣列芯片作用的最直觀的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)了4種肺癌標(biāo)志物各自在4種體積分?jǐn)?shù)梯度下的數(shù)據(jù)。每次實(shí)驗(yàn)肺癌標(biāo)志物氣體與陣列芯片反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為20 min，每類(lèi)氣體樣本均進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3．1 響應(yīng)差譜圖分析

通過(guò)對(duì)4種肺癌標(biāo)志物在設(shè)定4種體積分?jǐn)?shù)梯度的有效識(shí)別，可以發(fā)現(xiàn)不同物質(zhì)的樣本差譜圖之間有顯著的差別（見(jiàn)圖2）。這主要是由于識(shí)別系統(tǒng)包含有各種類(lèi)型的敏感物質(zhì)，可以產(chǎn)生不同的分子間相互作用（如成鍵形式、酸堿相互作用、偶極多極作用、氫鍵作用、π-π共軛作用、范德華力和物理吸附等），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肺癌標(biāo)志物多方位的綜合響應(yīng)。這種識(shí)別模式一方面可以充分體現(xiàn)某一具體作用因子與待測(cè)物的作用效果，另一方面也可以避免單一作用因子對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物在識(shí)別表達(dá)上的不足與缺陷。同理，在對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的同一物質(zhì)樣本進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)，陣列系統(tǒng)也可以將樣本在體積分?jǐn)?shù)之間的差異通過(guò)多種光譜的放大作用，實(shí)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)梯度樣本之間清晰的變化。

3．2 聚類(lèi)分析

聚類(lèi)是將數(shù)據(jù)分類(lèi)到不同簇這樣的一個(gè)過(guò)程，同一個(gè)簇的對(duì)象有很大的相似性，而不同簇間的對(duì)象有很大的相異性。這種分析方法可以對(duì)所有維度的數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)總體判定分類(lèi)，與線性判別分析相比，聚類(lèi)分析信息量更加全面真實(shí)。首先得到4種肺癌標(biāo)志物氣體在4種體積分?jǐn)?shù)梯度下基于108維度的ΔRGB空間的數(shù)據(jù)，利用SPSS軟件分析所得的聚類(lèi)圖（見(jiàn)圖3）。在相似度為10時(shí)，陣列系統(tǒng)就可以將不同種物質(zhì)及其所處的體積分?jǐn)?shù)梯度明顯地分開(kāi)，并且80次實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有一例結(jié)果出現(xiàn)分錯(cuò)現(xiàn)象。而且在逐級(jí)聚類(lèi)的過(guò)程中，不同物質(zhì)間結(jié)構(gòu)更相似的會(huì)優(yōu)先聚到一簇，如苯乙烯與1，2，4—三甲基苯會(huì)先聚到一簇，而正丁烷與正戊烷會(huì)先聚到另一簇。同時(shí)，同種物質(zhì)體積分?jǐn)?shù)相近的也會(huì)優(yōu)先聚到一簇，如“體積分?jǐn)?shù)1”與“體積分?jǐn)?shù)2”會(huì)先聚到一簇，“體積分?jǐn)?shù)3”與“體積分?jǐn)?shù)4”會(huì)先聚到另一簇。

圖2 肺癌標(biāo)志物與陣列芯片作用差譜圖Fig 2 Average color change profiles of lung cancer markers visualized as color difference maps

圖3 4種肺癌標(biāo)志物4種體積分?jǐn)?shù)下聚類(lèi)分析圖Fig 3 Cluster analysis plots for four kinds of lung cancer markers in four volume fraction gradients

3．3 主成分分析

陣列如此高維度的數(shù)據(jù)信息，必然增加分析判別的復(fù)雜程度，因此，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。利用主成分分析（PCA）技術(shù)，通過(guò)對(duì)4種肺癌標(biāo)志物4個(gè)體積分?jǐn)?shù)梯度下80次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)做主成分分析處理，發(fā)現(xiàn)前5個(gè)主成分代表了108維顏色通道數(shù)據(jù)庫(kù)所含信息量的91．9%，前9個(gè)主成分代表了95．5%的信息量（見(jiàn)圖4）。而以往的大多數(shù)電子鼻類(lèi)產(chǎn)品的前2個(gè)主成分就可以代表95%～99%的信息量。因?yàn)橐詡鞲衅鞯奶匦詠?lái)分析，代表相同信息量所需的主成分越多，傳感器對(duì)不同物質(zhì)的區(qū)分能力越強(qiáng)。因此，該陣列系統(tǒng)相比一般的電子鼻更適宜于對(duì)相似物的區(qū)分識(shí)別。

圖4 對(duì)4種肺癌標(biāo)志物4種體積分?jǐn)?shù)梯度下80次實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行主成分分析得到的前9個(gè)主成分累積圖Fig 4 The 9 most important principal components obtained from PCA of 80 time sample in four volume fraction gradients of four kinds of lung cancer markers

以主成分分析結(jié)果中的第一主成分為橫坐標(biāo)，第二主成分為縱坐標(biāo)做出樣本的二維散點(diǎn)分布圖（見(jiàn)圖5）。盡管前二維主成分只占全部信息量的72．0%，但是已經(jīng)可以將4種肺癌標(biāo)志物樣本清楚地區(qū)分開(kāi)。從圖中同種物質(zhì)不同體積分?jǐn)?shù)樣本的散點(diǎn)圖坐標(biāo)在第一主成分上的投影也可以看出:第一主成分可以體現(xiàn)樣本體積分?jǐn)?shù)梯度的變化。從散點(diǎn)圖坐標(biāo)在第二主成分上的投影來(lái)看，含有苯環(huán)類(lèi)標(biāo)志物均處于縱軸零坐標(biāo)以上的正值方向，而直鏈烷烴類(lèi)標(biāo)志物均處于縱軸零坐標(biāo)以下的負(fù)值方向，由此可見(jiàn)第二主成分可能主要體現(xiàn)的傳感陣列與標(biāo)志物之間π-π共軛的作用。

圖5 以前2個(gè)主成分為軸的樣本二維散點(diǎn)圖Fig 5 Sample 2D plot using the two most important principal components as axis

4 結(jié)論

本研究采用一種可視化傳感器系統(tǒng)對(duì)肺癌標(biāo)志物中的4種標(biāo)志物樣本進(jìn)行檢測(cè)，并利用聚類(lèi)分析、主成分分析技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)4種肺癌標(biāo)志物得到理想的分類(lèi)與識(shí)別。同時(shí)對(duì)比可視化指紋圖譜的差異，可以直觀地識(shí)別出不同種類(lèi)和不同體積分?jǐn)?shù)的樣本，達(dá)到可視化效果。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，所有的樣本均能得到正確的分類(lèi)，且結(jié)構(gòu)相近和體積分?jǐn)?shù)相近的樣本也會(huì)優(yōu)先聚到一簇。通過(guò)主成分分析，其前兩個(gè)主成分所代表的二維散點(diǎn)圖上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的清楚識(shí)別區(qū)分，而前9個(gè)主成分代表95．5%信息量的結(jié)果更進(jìn)一步體現(xiàn)了該傳感器系統(tǒng)在區(qū)分相似物質(zhì)上的優(yōu)勢(shì)。研究表明:該可視化傳感器陣列系統(tǒng)是一種快速有效的檢測(cè)識(shí)別肺癌標(biāo)志物的方法。

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