楊 靜 于巖波 于 卉 左秀麗 陳哲宇 李延青#

山東省千佛山醫(yī)院消化內(nèi)科1（250014） 山東大學齊魯醫(yī)院消化內(nèi)科2 山東大學醫(yī)學院神經(jīng)生物學研究所3

腹部不適和疼痛是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）患者的臨床常見癥狀。目前認為內(nèi)臟高敏感是IBD和IBS患者相關(guān)疼痛癥狀的主要病理生理機制，表現(xiàn)為對直腸擴張刺激的感覺閾值降低和（或）對刺激的反應(yīng)強度增加[1]。IBD和IBS患者常伴有尿頻、尿急、排尿痛等膀胱高敏感并發(fā)癥，這些并發(fā)癥加重了對患者生活質(zhì)量的負面影響，但發(fā)病機制尚不清楚。內(nèi)臟感覺通過胞體位于背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia,DRG）的脊髓內(nèi)臟傳入纖維傳遞至次級感覺神經(jīng)元，進而投射至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]。DRG內(nèi)關(guān)鍵分子的調(diào)控作用以及表達已成為近年內(nèi)臟敏感性機制研究的熱點。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)家族成員，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有表達。近年研究發(fā)現(xiàn)BDNF參與調(diào)控痛覺的轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]，然而系統(tǒng)應(yīng)用BDNF基因敲除（BDNF+/-）小鼠研究BDNF在內(nèi)臟敏感性中的調(diào)節(jié)作用尚未見報道。本研究以三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)建立BDNF+/-小鼠結(jié)腸炎后內(nèi)臟高敏感模型，旨在探討B(tài)DNF是否參與小鼠內(nèi)臟敏感性的調(diào)節(jié)。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

雜合子BDNF+/-C57BL/6小鼠38只和同窩正常野生型（BDNF+/+）C57BL/6小鼠38只由山東大學神經(jīng)生物學實驗室饋贈。從鼠尾組織標本中提取DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）行基因分型。小鼠于（21±1）℃溫度、50%±5%空氣濕度、避強光的環(huán)境中喂養(yǎng)，自由飲水、攝食。

TNBS、苯巴比妥鈉（Sigma 公司），ELISA BDNF試劑盒（Promega公司）。BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），乙醇、多聚甲醛等購自天津市大茂化學試劑廠。

二、動物分組和模型建立

所有小鼠分為BDNF+/+對照組、BDNF+/+TNBS炎癥組、BDNF+/-對照組和BDNF+/-TNBS炎癥組，每組各19只。按照Engel等[4]的方法制備結(jié)腸炎后內(nèi)臟高敏感小鼠模型。1.75 mg TNBS溶解于50%的乙醇中，終體積為0.1 mL。以注射器吸取配置好的TNBS，然后與一內(nèi)徑為1.2 mm的聚乙烯塑料管相連，導(dǎo)管末端用石蠟油充分潤滑以避免操作對結(jié)腸黏膜的物理性損傷。小鼠灌腸前24 h禁食不禁水，乙醚吸入麻醉后，將導(dǎo)管緩慢插入降結(jié)腸直至導(dǎo)管末端距小鼠肛門約4 cm處，將TNBS緩緩?fù)迫虢到Y(jié)腸。為避免TNBS外漏，保持小鼠倒立約30 s。對照組給予同等劑量的50%乙醇。

三、結(jié)腸和膀胱組織學檢查

造模7 d后，每組隨機取7只小鼠腹腔注射過量苯巴比妥鈉（200 mg/kg）處死，取遠端3 cm的降結(jié)腸和膀胱，于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm，行HE染色。由對實驗設(shè)計和操作全盲的病理醫(yī)師行結(jié)腸組織學半定量評分[5]：0 分，正常無炎癥；1 分，低度炎癥；2 分，中等炎性粒細胞浸潤；3分，高度炎性粒細胞浸潤，高度血管密度，腸壁增厚；4分，透壁炎癥，杯狀細胞缺失，高度血管密度，腸壁增厚。膀胱組織病理學半定量評分[6]：0分，正常無炎癥；1分，低度炎癥，無或低度水腫；2分，中度炎性浸潤和水腫；3分，重度炎性浸潤和水腫。

四、ELISA測定DRG內(nèi)BDNF表達

上述行組織學檢查的小鼠同時快速取支配結(jié)腸的脊髓胸腰部 T10-L1（TL）和腰骶部 L6-S1（LS）DRG，加入蛋白裂解緩沖液裂解30 min，行BCA蛋白定量。嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測BDNF蛋白表達。

五、內(nèi)臟敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠行結(jié)直腸擴張（colorectal distension,CRD）并記錄腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex,AWR）評分[7]。 乙醚輕度麻醉小鼠后，將緊密連接于聚四氟乙烯導(dǎo)管上特制的 2 cm聚乙烯塑料球囊輕輕插入降結(jié)腸，球囊近端距肛門約0.5 cm，導(dǎo)管用膠布固定于鼠尾。導(dǎo)管另一端緊密連接水銀血壓計。待小鼠充分蘇醒并適應(yīng)后，分別在 0、15、30、45、60 和 80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力下行結(jié)腸球囊擴張。每次擴張持續(xù)20 s，間隔4 min。由對實驗設(shè)計全盲的觀察者記錄不同壓力下AWR評分，所有測量均重復(fù)3次。AWR評分系統(tǒng)：0分：對球囊擴張無反應(yīng)；1分：身體靜止不動或頭部運動減少；2分：腹部肌肉收縮；3分：腹部抬高；4分：骨盆抬起，身體呈弓形。

六、膀胱敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠以1.2 g/kg氨基甲酸酯腹腔注射麻醉，中下腹部逐層剖開，暴露出膀胱，在膀胱頂部制一小切口，緩緩插入PE50導(dǎo)管，以氨基丙烯酸酯黏膠固定，15 min后膀胱排空。導(dǎo)管另一端通過三通管連接至灌流泵和壓力換能器上。2 min后，0.9%NaCl溶液以20 μL/min的速度持續(xù)灌流2 h，建立穩(wěn)定而可重復(fù)排尿的膀胱內(nèi)壓測量系統(tǒng)。記錄三次排尿間隔時間[8]，取均值。

七、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、結(jié)腸和膀胱組織學檢查

對于兩種不同基因型的小鼠，TNBS均可誘導(dǎo)明顯的結(jié)腸炎癥，組織學檢查表現(xiàn)為節(jié)段性潰瘍形成，腸黏膜中度充血水腫，大量炎性粒細胞浸潤和部分上皮壞死脫落（見圖1）。BDNF+/+TNBS炎癥組結(jié)腸組織學評分顯著高于BDNF+/+對照組（P<0.01），BDNF+/-TNBS炎癥組評分亦顯著高于BDNF+/-對照組（P<0.01），而兩個炎癥組之間相比無明顯差異（見表 1）。

各組小鼠膀胱組織學切片均顯示結(jié)構(gòu)正常完整，無炎癥指征（見圖2），組織學評分均為0。

二、DRG內(nèi)BDNF蛋白表達

非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠支配結(jié)腸的TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達均約為BDNF+/+小鼠的一半，組間相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩種不同基因型的TNBS炎癥組TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達均顯著高于相應(yīng)對照組（P<0.01）。BDNF+/-TNBS炎癥組TL和LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達顯著低于 BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.001）（見表 1）。

三、不同擴張壓力下小鼠AWR評分

非炎癥狀態(tài)下，擴張壓力<60 mm Hg時，BDNF+/-小鼠AWR評分與BDNF+/+小鼠相比無明顯差異；而擴張壓力為60、80 mm Hg時，BDNF+/+小鼠AWR評分顯著高于BDNF+/-小鼠（P<0.05）。在BDNF+/+小鼠中，擴張壓力≥30 mm Hg時，TNBS炎癥組AWR評分顯著高于對照組（P<0.01）；擴張壓力<30 mm Hg時兩組無明顯差異。在BDNF+/-小鼠中，擴張壓力≥45 mm Hg時，TNBS炎癥組AWR評分顯著高于對照組（P<0.01）；擴張壓力<45 mm Hg時兩組無明顯差異。擴張壓力≥30 mm Hg時，BDNF+/-TNBS炎癥組AWR評分顯著低于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.05）（見表 1、圖 3）。

表1 各組小鼠結(jié)腸組織學評分、BDNF蛋白表達、AWR評分和排尿間隔比較（）

表1 各組小鼠結(jié)腸組織學評分、BDNF蛋白表達、AWR評分和排尿間隔比較（）

與同基因型對照組比較，*P<0.01，**P<0.001；與 BDNF+/+TNBS 炎癥組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；△與 BDNF+/+對照組比較，P<0.05

四、膀胱敏感性

非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠與BDNF+/+小鼠的排尿間隔相比無明顯差異。兩種不同基因型TNBS炎癥組排尿間隔均顯著短于相應(yīng)對照組（P<0.001）。BDNF+/-TNBS炎癥組排尿間隔顯著高于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.01）（見表 1）。

討 論

根據(jù)解剖學分布特點，支配結(jié)腸DRG的神經(jīng)元纖維主要分為兩類：一類為內(nèi)臟神經(jīng)，神經(jīng)元胞體位于脊髓胸腰段T10-L1；另一類為盆神經(jīng)，胞體位于脊髓腰骶段L6-S1[9]。這些神經(jīng)纖維裸露的末梢分布于腸壁各層，分別沿著交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)走行，穿過椎旁節(jié)和椎前節(jié)，到達脊髓后角。內(nèi)臟敏感性的變化主要由外周和中樞機制引起[2]。各種原因引起的感覺神經(jīng)末梢和初級傳入神經(jīng)元的致敏均可誘導(dǎo)中樞敏感化，探索DRG內(nèi)參與結(jié)腸炎后致敏的關(guān)鍵分子對明確結(jié)腸高敏感的發(fā)生機制有重要意義。

BDNF廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)，可維持胚胎期神經(jīng)元的存活、分化，并參與調(diào)節(jié)成熟神經(jīng)元的功能。既往研究認為，BDNF可調(diào)控突觸可塑性，并參與學習、記憶等多項功能[10]。有研究發(fā)現(xiàn)BDNF亦參與痛覺的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控[3]。在外周炎癥誘導(dǎo)的疼痛模型中，DRG內(nèi)BDNF表達明顯上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射BDNF抗體能抑制后足切割疼痛模型的痛覺過敏，表明BDNF參與神經(jīng)源性軀體疼痛[11]。臨床研究[12]亦發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎患者的胰腺組織內(nèi)BDNF表達明顯上調(diào)，并與胰腺炎性疼痛的發(fā)生密切相關(guān)。本研究中，非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠DRG內(nèi)BDNF蛋白表達明顯低于BDNF+/+小鼠，但兩種基因型小鼠間結(jié)腸敏感性無明顯差異。僅球囊擴張壓力≥60 mm Hg時，相較于BDNF+/+小鼠，BDNF+/-小鼠表現(xiàn)為結(jié)腸低反應(yīng)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于BDNF+/-和BDNF+/+小鼠，TNBS均有顯著的炎性致敏作用。TNBS模型是研究腸道傳入神經(jīng)外周致敏化機制的重要手段。大量研究發(fā)現(xiàn)TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后，局部可釋放炎性介質(zhì)如P物質(zhì)、緩激肽、前列腺素E2、降鈣素基因相關(guān)肽等[13～15]。分布于消化道壁的初級傳入纖維末梢受到這些炎性介質(zhì)的刺激活化，將感覺信號放大傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。BDNF可能與上述炎性介質(zhì)共同協(xié)作參與炎性內(nèi)臟高敏感的調(diào)控。本研究結(jié)果證實，TNBS誘導(dǎo)炎癥后兩種不同基因型小鼠DRG內(nèi)BDNF表達均增加，同時伴有結(jié)腸高敏感。結(jié)腸炎后BDNF+/-小鼠BDNF表達明顯低于BDNF+/+小鼠，同時結(jié)腸敏感性亦低于BDNF+/+小鼠。提示BDNF參與結(jié)腸炎后的內(nèi)臟致敏。而在非炎癥狀態(tài)下，低壓力 CRD時，BDNF+/+和 BDNF+/-小鼠之間AWR評分無明顯差異，這可能源自于BDNF的生物學特性。BDNF在DRG中主要分布于中小直徑的神經(jīng)元，而中小直徑神經(jīng)元發(fā)出Aδ和C類纖維，傳遞傷害性感覺，為高閾值感受器[17]，因此非炎癥狀態(tài)時BDNF部分敲除對于較低壓力的非傷害性結(jié)腸刺激無明顯抑制作用，可能由BDNF高閾值感受器的特性所致。

臨床上IBD和IBS患者除反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉等消化道癥狀外，常伴有尿頻、尿急、尿痛等膀胱高反應(yīng)性的并發(fā)癥。目前觀點認為這種腹腔臟器的癥狀重疊可能來自于支配不同臟器的神經(jīng)在DRG水平的 “集合”（convergence）[18]。應(yīng)用逆行熒光示蹤技術(shù)，標記小鼠DRG內(nèi)來自膀胱和結(jié)腸的神經(jīng)元，證實兩者在 TL DRG（T13-L1）和 LS DRG（L5-S1）內(nèi)存在一定比例的重合[19]。作為感覺信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的“門控”，研究參與DRG水平神經(jīng)元“集合”的關(guān)鍵分子對揭示牽涉性膀胱高敏感具有重要意義。

Qin等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸炎模型膀胱壁無組織病理學改變。本研究中，以TNBS建立小鼠結(jié)腸炎模型，亦發(fā)現(xiàn)膀胱無炎癥表現(xiàn)，組織結(jié)構(gòu)正常完整；BDNF+/-炎癥小鼠的膀胱敏感性顯著低于BDNF+/+炎癥小鼠，而在非炎癥狀態(tài)下，BDNF部分敲除對膀胱敏感性無明顯影響。提示BDNF可能在DRG水平參與牽涉性膀胱高敏感的發(fā)生，其作用趨向于調(diào)控者而非始發(fā)因子，且調(diào)控作用可能亦需在結(jié)腸炎癥狀態(tài)下由多種炎性介質(zhì)的刺激和協(xié)同作用而實現(xiàn)。

綜上所述，本研究通過應(yīng)用BDNF基因敲除小鼠，證實BDNF參與結(jié)腸炎后結(jié)腸高敏感和牽涉性膀胱高敏感的發(fā)生，為研制針對腹痛癥狀的藥物提供了一定的理論依據(jù)。

1 Agrawal A,Houghton LA,Lea R,et al.Bloating and distention in irritable bowel syndrome:the role of visceral sensation[J].Gastroenterology,2008,134(7):1882-1889.

2 Gebhart GF.Pathobiology of visceral pain:molecular mechanisms and therapeutic implicationsⅣ.Visceral afferent contributions to the pathobiology of visceral pain[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2000,278(6):G834-G838.

3 Obata K,Noguchi K.BDNF in sensory neurons and chronic pain[J].Neurosci Res,2006,55(1):1-10.

4 Engel MA,Kellermann CA,Burnat G,et al.Mice lacking cannabinoid CB1-,CB2-receptors or both receptors show increased susceptibility to trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)-induced colitis[J].J Physiol Pharmacol,2010,61(1):89-97.

5 Elliott DE,Li J,Blum A,et al.Exposure to schistosome eggs protects mice from TNBS-induced colitis[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003,284 (3):G385-G391.

6 Liu W,Evanoff DP,Chen X,et al.Urinary bladder epithelium antigen induces CD8+ T cell tolerance,activation,and autoimmune response[J].J Immunol,2007,178(1):539-546.

7 Long Y,Liu Y,Tong J,et al.Effectiveness of trimebutine maleate on modulating intestinal hypercontractility in a mouse model of postinfectious irritable bowel syndrome[J].Eur J Pharmacol,2010,636(1-3):159-165.

8 Lamb K,Zhong F,Gebhart GF,et al.Experimental colitis in mice and sensitization of converging visceral and somatic afferent pathways[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,290(3):G451-G457.

9 Brierley SM,Castro J,Harrington AM,et al.TRPA1 contributes to specific mechanically activated currents and sensory neuron mechanical hypersensitivity[J].J Physiol,2011,589(Pt 14):3575-3593.

10 Chen ZY,Jing D,Bath KG,et al.Genetic variant BDNF(Val66Met)polymorphism alters anxiety-related behavior[J].Science,2006,314(5796):140-143.

11 Li CQ,Xu JM,Liu D,et al.Brain derived neurotrophic factor (BDNF)contributes to the pain hypersensitivity following surgical incision in the rats[J].Mol Pain,2008,4:27.

12 ZhuZW,FriessH,WangL,etal.Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)is upregulated and associated with pain in chronic pancreatitis[J].Dig Dis Sci,2001,46(8):1633-1639.

13 張峰,袁川評,柳巨雄,等.SP和CGRP在炎癥性腸病大鼠結(jié)腸中的表達規(guī)律[J].中國比較醫(yī)學,2011,21(12):26-30.

14 Hara DB,Leite DF,Fernandes ES,et al.The relevance of kinin B1 receptor upregulation in a mouse model of colitis[J].Br J Pharmacol,2008,154(6):1276-1286.

15 Ancha HR,Kurella RR,McKimmey CC,et al.Effects of N-acetylcysteine plus mesalamine on prostaglandin synthesis and nitric oxide generation in TNBS-induced colitis in rats[J].Dig Dis Sci,2009,54(4):758-766.

16 Peiris M,Bulmer DC,Baker MD,et al.Human visceral afferent recordings:preliminary report[J].Gut,2011,60(2):204-208.

17 Zhou XF, Rush RA. Endogenous brain-derived neurotrophic factor is anterogradely transported in primary sensory neurons[J].Neuroscience,1996,74(4):945-953.

18 Bielefeldt K,Lamb K,Gebhart GF.Convergence of sensory pathways in the development of somatic and visceral hypersensitivity[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2006,291(4):G658-G665.

19 Christianson JA, Liang R, Ustinova EE, et al.Convergence of bladder and colon sensory innervation occurs at the primary afferent level[J].Pain,2007,128(3):235-243.

20 Qin C,Malykhina AP,Akbarali HI,et al.Cross-organ sensitization of lumbosacral spinal neurons receiving urinary bladder input in rats with inflamed colon[J].Gastroenterology,2005,129(6):1967-1978.