范明明，毛煒陶，楊 靜，張萍波

（江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

應(yīng)用技術(shù)

脂肪酸甲酯（生物柴油）的定性/定量分析方法

范明明，毛煒陶，楊 靜，張萍波

（江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

生物柴油作為一種可替代石化柴油的清潔能源，已受到人們的廣泛關(guān)注。本文討論了國內(nèi)外對生物柴油的多種分析方法，如氣相色譜、液相色譜、熱重分析、核磁共振氫譜和傅里葉變換紅外光譜等，并對部分分析方法進行了實驗驗證，總括并比較了多種分析方法的優(yōu)缺點：氣相色譜、液相色譜適用于定量分析；TGA準確度高；1H NMR操作簡單、準確，但成本高；FTIR適用于定性；NIR成本低，精確度較差。

生物柴油；酯交換；氣相色譜；熱重分析；核磁共振氫譜

生物柴油是指以動植物油脂、工程微藻及餐飲垃圾油等為原料，通過與短鏈醇（常用甲醇）進行酯交換反應(yīng)生成的脂肪酸單烷基酯類物質(zhì)，是可完全或部分代替石化柴油的可再生性柴油燃料[1-2]。當前，有關(guān)生物柴油的研究已越來越受世界各國的重視與肯定[3]。圍繞生物柴油研究過程中涉及的分析方法的建立和完善，尤其是建立一種簡潔、快速的分析方法對脂肪酸甲酯進行定性或定量分析有重要的意義[4-6]，許多學(xué)者做了大量的工作。但很少有人將目前國內(nèi)外研究應(yīng)用比較廣泛的檢測手段如氣相色譜、高效液相色譜、熱重分析、核磁共振氫譜和傅里葉變換紅外光譜等進行全面而詳盡地綜述及比較，本文將結(jié)合文獻與作者做的一些實驗，總括并比較多種分析方法的優(yōu)缺點，探討了哪些方法能進行定量分析而哪些方法只能進行定性分析，以便于研究和生產(chǎn)者很好的了解和選擇生物柴油分析方法。

1 氣相色譜

目前，國內(nèi)有關(guān)生物柴油在產(chǎn)物中脂肪酸甲酯含量和分布的測定，多以氣相色譜（GC）為主，因其具有快捷、靈敏度高、重復(fù)性好等特點。李長秀等[7]綜述了氣相色譜分析方法在生物柴油生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用，如原料、甲酯含量和組成分布以及甲醇含量等，重點在酯交換產(chǎn)物中甲酯含量測定，并提出一種用正丙醇作內(nèi)標用雙柱壓力反吹的方式測定生物柴油產(chǎn)品中微量甲醇含量的方法，采用極性聚乙二醇色譜柱測定了8種脂肪酸甲酯的含量；張振乾等[8]以十七酸甲酯為內(nèi)標物，分別建立了菜籽油中各脂肪酸甲酯組分的線性方程，確保測定結(jié)果的準確性；劉祥華等[9]以十三酸甲酯為內(nèi)標，建立了氣相色譜法測定生物柴油中脂肪酸甲酯含量的方法。以上方法只考察不同的脂肪酸甲酯含量，計算甲酯的收率，而不考慮甘油酯含量。曾建立[10]采用高溫氣相色譜分析法，對反應(yīng)樣品中各種脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油酯進行很好的定量。國外部分文獻報道采用氣相色譜法測定生物柴油中脂肪酸甲酯含量[11-14]。

針對國內(nèi)常用氣相色譜設(shè)備及實驗條件，作者采用GC-9790型氣相色譜儀，以水楊酸甲酯為內(nèi)標物，PEG-20M色譜柱，建立了測定大豆油生物柴油中主要脂肪酸甲酯（亞油酸甲酯、油酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、亞麻酸甲酯）含量的氣相色譜法，操作簡便快捷。

1.1 色譜條件

柱溫150 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至終溫215 ℃ ，保持6 min；汽化室和檢測器溫度280℃；載氣（N2）柱前壓0.1 MPa；燃燒氣（H2）柱前壓0.1 MPa；助燃氣（空氣）柱前壓0.03 MPa；分流比50∶1；進樣量0.2 μL。

待測組分收率計算見式（1）、式（2）。

式中，Wi為甲酯收率；fi為待測組分的相對質(zhì)量校正因子；Ai為待測組分甲酯峰面積；A0為內(nèi)標物水楊酸甲酯峰面積；m0為內(nèi)標物水楊酸甲酯稱樣量，g；mz為試樣稱樣量，g；mi為標準樣品稱樣量，g。通過對各項標準組分進行氣相色譜分析，每種組分重復(fù)進樣3次，通過式（2）得各組分相對質(zhì)量校正因子；進一步對樣品進樣，通過式（1）可得甲酯含量。

1.2 檢測結(jié)果

采用內(nèi)標法進行定量分析，關(guān)鍵是需要選擇適宜的組分作待測組分的內(nèi)標物，來根據(jù)樣品和內(nèi)標物的量及待測組分和內(nèi)標物峰面積計算含量。內(nèi)標物可有多種選擇，依據(jù)所采用不同氣相色譜分離柱應(yīng)有不同考慮，但其基本選擇要求需滿足以下幾點：與樣品組分不能發(fā)生反應(yīng)；樣品中不含內(nèi)標物；內(nèi)標物與待測組分能完全分離，且色譜峰位置相近；內(nèi)標物濃度恰當，使其峰面積與待測組分相差不大。

在上述色譜條件下，大豆油生物柴油測定色譜圖見圖1，結(jié)果顯示在20 min內(nèi)生物柴油脂肪酸甲酯各組分分離明顯，峰形良好?？梢姡瑲庀嗌V為生物柴油的分析提供了一種有效測試手段，分離效果好、快捷、便宜，前提是需要添加內(nèi)標物，有高溫色譜柱，該方法可作為產(chǎn)物定量分析的重要參考。

圖1 生物柴油的氣相色譜圖

2 高效液相色譜

生物柴油檢測在國內(nèi)以GC為主， 但其在測定沸點高、相對分子質(zhì)量大、不易揮發(fā)物質(zhì)時存在局限性，若采用內(nèi)標法制樣時還另需內(nèi)標物；采用液相色譜，樣品產(chǎn)物只需簡單預(yù)處理，有靈敏度高、分離效果顯著、時間短等優(yōu)點，也不失為一種準確有效的測試手段。國內(nèi)方面，李一哲等[14]采用超高效液相色譜（UPLC）-蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），以乙腈和水混合液為流動相進行等度洗脫，建立了一種簡單快速高效的方法測定生物柴油中11種常見的脂肪酸及脂肪酸甲酯含量；李凱欣等[15]利用高效液相色譜，以乙腈為流動相等度洗脫，10 min內(nèi)能對麻瘋油酯交換產(chǎn)物進行良好分離；張大華等[16]用液相色譜法分離，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對菜籽油制備生物柴油中產(chǎn)物進行定性，通過外標法定量建立了一種簡單快速準確的定性定量分析方法。國外也有學(xué)者采用高效液相色譜對生物柴油中產(chǎn)物進行定性分析[17-19]。

作者采用Waters HPLC高效液相色譜儀、Waters 2489 紫外-可見光檢測器、Benetnach C18 色譜柱，建立了測定大豆油生物柴油中主要脂肪酸甲酯含量的高效液相色譜法。

2.1 色譜條件

色譜柱為Benetnach C18 色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（色譜純），等度洗脫；流速1 mL/min；進樣量20 μL；柱溫40 ℃，紫外檢測波長210 nm。

2.2 檢測結(jié)果

脂肪酸甲酯為高碳數(shù)酯類化合物，且具有一定極性，在選擇色譜柱時更優(yōu)先考慮耐高溫性好，有良好惰性的強極性柱。選擇了C18柱，結(jié)果證明該柱能良好分離脂肪酸甲酯各色譜峰。在純乙腈等度洗脫的簡單條件下，紫外光檢測器對各種脂肪酸甲酯色譜峰有良好分離效果。在200～300 nm范圍內(nèi)用紫外可見光光度儀掃描，至脂肪酸甲酯最大吸收波長約為210 nm，因此紫外檢測波長選擇210 nm。

在上述優(yōu)化色譜條件下，得大豆油生物柴油高效液相色譜圖如圖2所示，并采用LC-MS法對其各保留時間峰所代表的主要成分進行鑒定。結(jié)果表明，通過紫外光檢測器液相色譜法，可以對大豆油制生物柴油中脂肪酸甲酯進行良好分離，若需定量分析只需以各脂肪酸甲酯標準物質(zhì)配制不同濃度標準樣，按上述分析條件進行液相色譜分析，繪制各脂肪酸甲酯的標準曲線，即可對產(chǎn)物進行定量分析。采用HPLC可以對生物柴油進行很好的定量分析，色譜分離效果好，存在的不足就是過程復(fù)雜、成本較高。

3 熱重分析

圖2 生物柴油的高效液相色譜圖

熱重分析法（TGA）是指在程序控制溫度下測量待測樣品的質(zhì)量與溫度變化關(guān)系的一種熱分析技術(shù)，常用來研究物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和組分。在程序控制溫度下，物質(zhì)質(zhì)量的損失與其蒸氣壓或者熱降解氣體成分有直接的關(guān)系。已有文獻報道[20-22]，生物柴油在150 ℃左右開始失重，在300 ℃基本上失重完全；而大豆油在350 ℃才開始失重，在500 ℃基本上失重完全?？梢?，采用TGA技術(shù)建立一套精密、快速、可行的分析生物柴油的轉(zhuǎn)化率和其產(chǎn)品質(zhì)量的方法是可行的，并有望推動生物柴油工業(yè)化的進程。作者采用Mettler-Toledo TGA/SDTA851E熱重分析儀，建立了測定大豆油生物柴油中主要脂肪酸甲酯含量的熱重分析法。

3.1 實驗條件

溫度設(shè)定：25～550 ℃，升溫速率為10 ℃/min。平衡氣為氮氣（50 mL/min），爐內(nèi)氣氛為氮氣（20 mL/min）。

3.2 檢測結(jié)果

TGA檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知，大豆油、生物柴油都能在500 ℃以下完全失重，生物柴油的失重范圍為100～300 ℃，而大豆油的范圍為320～500 ℃，所以兩者能很好的區(qū)分開來。由圖4可知：在100 ℃下有微量的失重，可能是體系中存在的微量水分。通過熱重圖的一階導(dǎo)數(shù)曲線看出：第一部分生物柴油的失重為60.4%，即原組分中脂肪酯甲酯含量為60.4%；第二部分大豆油的失重為39.16%，即原組分中大豆油為39.16%。但是，采用熱重分析生物柴油的含量，不需要標樣、溶劑，準確度高，但是值得注意的是測定前必須將產(chǎn)物中雜質(zhì)（水分、甘油）去除，以免對分析帶來誤差。

4 核磁共振氫譜

圖3 大豆油和生物柴油的熱重曲線圖

圖4 生物柴油和大豆油混合物的熱重曲線圖

核磁共振（NMR）是分析有機結(jié)構(gòu)的重要方法，也同樣可以用來分析酯交換合成脂肪酸甲酯反應(yīng)產(chǎn)率。此方法研究應(yīng)用以國外為主，Costa等[23]建立了利用核磁進行大豆油與乙醇酯交換反應(yīng)產(chǎn)率分析的方法，利用脂肪酸乙酯和甘油上亞甲基氫質(zhì)子的迭代峰進行產(chǎn)率計算；Miyake等[24]利用13C NMR分析動植物油脂中存在的0、1、2、3個碳碳雙鍵，并定量分析出相應(yīng)的含不同雙鍵數(shù)脂肪酸的組成；Knothe等[25]應(yīng)用光纖核磁共振分析植物油（大豆油）轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯的甲酯化率，結(jié)果顯示與應(yīng)用氫質(zhì)子核磁共振分析結(jié)果相關(guān)。

作者采用Bruker Avance III核磁共振儀（400 MHz），CDCl3為溶劑，對大豆油酯交換生物柴油產(chǎn)物進行了定性定量分析，為生物柴油分析提供了一種參考依據(jù)。

4.1 實驗原理

利用1H NMR進行分析的主要原理是甘油三酸酯中酯基團一側(cè)的亞甲基氫質(zhì)子信號在δ為2.3處出峰，反應(yīng)結(jié)束后脂肪酸甲酯上的甲氧基氫質(zhì)子在δ為3.7處出峰（圖5、圖6）。利用亞甲基信號峰面積與甲氧基質(zhì)子信號峰面積比，可以計算酯交換產(chǎn)率，見式（3）。

PCR擴增：利用引物27F和1492R對細菌基因組16S rDNA進行擴增，27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。擴增體系(25μL)：10×PCR buffer2.5μL，dNTP(2.5mmol/L each)1 μL，DNA10 ng，引物 F(10 μmol/L)0.5 μL，引物R(10 μmol/L)0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴增程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃60 s，共30個循環(huán)；72℃10 min，4℃終止反應(yīng)。

圖5 酯交換反應(yīng)中氫質(zhì)子化學(xué)位移

圖6 生物柴油的核磁共振氫譜圖

式中，C為甘油三酸酯轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率；AME為脂肪酸甲酯上甲氧基處氫質(zhì)子峰面積值；ACH2為亞甲基處氫質(zhì)子峰面積值。因甲氧基處氫質(zhì)子有3個，亞甲基處氫質(zhì)子為2個，因此需要乘以系數(shù)2/3得此公式，計算簡單。

4.2 檢測結(jié)果

利用1H NMR對脂肪酸甲酯含量進行分析，相比于GC、HPLC等操作最為快捷簡便，也可以準確定量脂肪酸甲酯含量，但相比下昂貴的價格成為了其作為一種脂肪酸甲酯常規(guī)分析手段的主要制約因素，國內(nèi)的研究者較少采用。生物柴油的1H NMR譜圖見圖6。

5 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）已經(jīng)成為了對有機化合物結(jié)構(gòu)分析的常用工具[26]。Connor等[27]對甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯的紅外譜圖進行了比較，發(fā)現(xiàn)根據(jù)—OH的伸縮振動區(qū)間，可以驗證甘油二酯和甘油一酯的存在，而甘油三酯沒有自由的—OH；根據(jù)C—O的最大吸收波長峰的不同，可區(qū)別甘油二酯和甘油一酯；脂肪酸甲酯和甘油三酯在指紋區(qū)有明顯的不同，從而可定性的了解油品分子結(jié)構(gòu)的變化。

作者采用FTLA2000傅里葉變換紅外光譜，薄膜法制樣（用毛細管將樣品均勻的涂到KBr鹽片上），紅外燈下烘去水分后再進行4000～500 cm－1范圍掃描。

通過原料大豆油和其催化酯交換合成的生物柴油的紅外譜圖進行比較，可確定前后分子結(jié)構(gòu)的一些變化。從圖7可知：原料大豆油和產(chǎn)物在3000～3600 cm－1羧羥基峰幾乎不出現(xiàn)，說明原料或產(chǎn)物中游離的羧酸、甘油二酯和甘油一酯的量都相當?shù)牡?；原料大豆油和產(chǎn)物在3000～1300 cm－1的基團特征吸收頻率區(qū)的吸收峰基本上是一致的，2926 cm－1、2855 cm－1處為烷基上C—H伸縮振動吸收峰、1743

cm－1處為C=O伸縮振動吸收峰、1300～1050 cm－1的強吸收峰等都基本一致的，證明了原料油和產(chǎn)物均為羧酸酯；對比1300～800 cm－1的指紋區(qū)，產(chǎn)物在1460 cm－1左右的烷基彎曲吸收振動峰裂分為雙強峰，說明產(chǎn)物中脂肪酸甲酯不止一種。產(chǎn)物中的1198 cm－1、1171 cm－1雙強峰為脂肪酸甲酯的特征吸收峰，850 cm－1、1017 cm－1兩峰分別為CH3O－基團的面內(nèi)和面上彎曲吸收振動特征峰，都證明了產(chǎn)物的確為多種脂肪酸甲酯組成。采用FTIR對生物柴油進行定性分析，快捷、操作簡單，而定量很難。

6 近紅外光譜

近紅外光譜法（NIR）具有無需對樣品預(yù)處理、操作方便快捷、投資及操作費用低、適合油料產(chǎn)品的定量和定性分析等優(yōu)點，已在石油化工過程中得到了廣泛的應(yīng)用[28]。

6.1 近紅外光譜的定性分析

在測定生物柴油樣品過程中，根據(jù)樣品中不同氫基團X—H（X=C、O等）振動的倍頻和合頻吸收峰位置，可定性的了解樣品化合物的組成和分子結(jié)構(gòu)?？状淦嫉萚29]分析了6類原料油合成生物柴油的近紅外光譜，發(fā)現(xiàn)甲基C—H的二級倍頻吸收峰為8609 cm－1、8316 cm－1；亞甲基C—H的第一組合頻吸收峰為7216 cm－1、7108 cm－1；甲基的一級倍頻為5828 cm－1；亞甲基的一級倍頻為5766 cm－1；甲酯中的C—H吸收峰為6005 cm－1。

6.2 近紅外光譜的定量分析

近紅外光譜法定量分析生物柴油是一種間接方法，是采用統(tǒng)計的方法在樣品待測屬性值與近紅外光譜數(shù)據(jù)之間建立一個關(guān)聯(lián)模型（或稱校正模型）。所以，關(guān)聯(lián)模型的建立[30]是近紅外光譜分析的核心技術(shù)之一，當前常用的方法有偏最小二乘（PLS）、多元線性回歸（MLR）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）。

綜上，采用NIR對生物柴油既可進行定性分析，也可進行定量分析，而定量分析需要進行建模，耗時，而且精確度欠缺。

7 凝膠滲透色譜

因三甘酯（TG）與甲醇的酯交換反應(yīng)是一個三步連續(xù)可逆反應(yīng)，產(chǎn)物中可能會殘留三甘酯、二甘酯（DG）和單甘酯（MG），所以，可以利用凝膠滲透色譜（GPC）研究酯交換反應(yīng)程度及產(chǎn)物含量。Darnoko等[31]采用外加折光指數(shù)檢測器的GPC對酯交換產(chǎn)物（TG、DG、MG、glycerol、MEs）建立起了一種快速分析方法。Fillieres等[32]運用GPC對菜籽油與乙醇在NaOH催化劑作用下的反應(yīng)評估了不同因素的影響，實現(xiàn)了GPC對其酯交換產(chǎn)物的定量過程。金付強等[33]對大麻籽油和甲醇二次酯交換反應(yīng)產(chǎn)物采用GPC分析，發(fā)現(xiàn)大麻籽油的出峰時間在30 min左右，大麻籽油第一次酯交換后，數(shù)均分子量由900.1降至299.5，經(jīng)第二次酯交換后，下降到291.0。采用GPC對生物柴油進行分析，分離效果好，常用于跟蹤反應(yīng)進程，而定量分析不是較佳選擇。

8 結(jié) 論

據(jù)統(tǒng)計[3]，目前全世界生物柴油生產(chǎn)能力3000×104t/a以上；我國在國家《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》中也提出了相應(yīng)的發(fā)展目標：到2020年產(chǎn)量要達到200×104t/a。由此可見，生物柴油因其環(huán)境友好且可再生作為礦物柴油的替代燃料備受人們的重視。然而，盡管生物柴油的產(chǎn)量不斷增加，但是由于原料的廣泛性、復(fù)雜性，從而導(dǎo)致生物柴油產(chǎn)物的復(fù)雜性，對其分析方法也帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本文不僅綜述了目前脂肪酸甲酯所常用的幾種分析手段，而且對其中的氣相色譜、高效液相色譜、熱重分析和核磁氫譜四種方法進行了相關(guān)實驗論證。不同分析手段優(yōu)缺點對比見表1。希望這些分析方法能為研究生產(chǎn)者提供便利，從而真正的推動生物柴油這一新型能源的發(fā)展。

表1 不同分析手段優(yōu)缺點對比

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Qualitative and quantitative analysis on fatty acid methyl ester（biodiesel）

FAN Mingming，MAO Weitao，YANG Jing，ZHANG Pingbo
（The Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology，Ministry of Education；School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

As an environmentally friendly，clean and alternative energy，biodiesel has attracted more and more attention in recent years. In this paper，various analysis methods for biodiesel were discussed，such as gas chromatography，liquid chromatography，thermogravimetric analysis，1H NMR ，F(xiàn)TIR and so on. Some analysis methods were verified through experiment．The advantages and disadvantages of various analysis methods are presented．GC and HPLC are suitable for quantitative analysis. TGA has high accuracy.1H NMR is easy to operate with high accuracy，but it has high cost. FTIR is suitable for qualitative analysis. NIR has low cost，but is less accurate.

biodiesel；transesterification；gas chromatography；thermogravimetric analysis；1H NMR

O 643；TQ 645

A

1000-6613（2012）06-1373-06

2012-01-10；修改稿日期：2012-02-16。

國家自然科學(xué)基金（21106054）、教育部博士點新教師基金（20100093120003）及中央高校基本業(yè)務(wù)費（JUSRP211A07）項目。

范明明（1978—），男，博士，副教授。聯(lián)系人：張萍波，博士，副教授，研究內(nèi)容為精細化學(xué)品的綠色合成。E-mail pingbozhang@126.com。