黃齊林，安雅睿，江小麗，陳 華，畢文姬，張 文*,金利通

（1.華東師范大學(xué)化學(xué)系，上海200062）

（2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)系，云南玉溪653100）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥病變，病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇沉積形成粥樣斑塊可引發(fā)血管管腔變細(xì)[1～2]。數(shù)據(jù)表明，動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因，超過(guò)65%的糖尿病患者死于動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥[3]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量隨著葡萄糖含量的增加而升高，且巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的大量沉積是動(dòng)脈粥樣硬化的主要病因[4～5]。為了探究高血糖和膽固醇在糖尿病引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的作用，有必要建立同時(shí)檢測(cè)大鼠血清和腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和膽固醇含量的有效實(shí)驗(yàn)方法。

該文研制了一種新型雙酶生物傳感器，用于大鼠血清與腹腔巨噬細(xì)胞（PMs）內(nèi)葡萄糖和膽固醇的同時(shí)檢測(cè)。首先在雙電極表面電聚合硫堇；然后將金納米粒子固定在聚硫堇（PTH）表面，吸附金納米粒子的聚硫堇不僅能夠保持酶的催化活性，而且可作為介電中心提高電子轉(zhuǎn)移速率；最后用殼聚糖做交聯(lián)劑將葡萄糖氧化酶(GOD)、膽固醇酯酶(ChE)和膽固醇氧化酶(ChOx)分別共價(jià)鍵合在雙電極的聚硫堇層上。通過(guò)檢測(cè)雙電極上的氧化電流大小即可間接檢測(cè)到葡萄糖和膽固醇的濃度。葡萄糖傳感器的線性范圍為8.0×10-6～6.0×10-3mol/L， 檢 測(cè) 限 為 2.0×10-6mol/L；膽固醇傳感器的線性范圍為2.0×10-6～1.0×10-3mol/L，檢測(cè)限為 0.6×10-6mol/L。 結(jié)果顯示該雙酶?jìng)鞲衅黛`敏度高，選擇性好。該傳感器成功用于同時(shí)檢測(cè)糖尿病大鼠血清及腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇的含量，取得令人滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 結(jié)果與討論

1.1 雙酶?jìng)鞲衅鞯淖饔脵C(jī)理

同時(shí)檢測(cè)葡萄糖和膽固醇的電化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理是將酶催化反應(yīng)和在酶活性中心和電極表面的電子媒介體（ETM）相結(jié)合。具體機(jī)理如圖1所示。GOD和ChOx均含有一種氧化還原活性中心，核黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），該活性中心能夠分別將葡萄糖和膽固醇催化水解為葡萄糖酸內(nèi)酯和4-膽甾烯-3-酮。同時(shí)，F(xiàn)AD被還原為FADH2。該催化過(guò)程中失去的2個(gè)電子將在PTH的兩電子/兩質(zhì)子的可逆?zhèn)鬟f過(guò)程中被傳遞至電極表面，兩電極上生成的電流與葡萄糖或膽固醇的濃度相關(guān)。

圖1 雙酶?jìng)鞲衅鞯淖饔脵C(jī)理

1.2 線性范圍與檢測(cè)限

圖2為葡萄糖傳感器和膽固醇傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。葡萄糖傳感器在8×10-6～6×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 7，檢測(cè)下限為 2.0×10-6mol/L（3 倍信噪比）；膽固醇傳感器的線性范圍為2×10-6～1×10-3mol/L，線性相關(guān)系數(shù)為 0.998 3，檢測(cè)下限為 0.6×10-6mol/L（3 倍信噪比）。

圖2 （A）葡萄糖傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線，（B）膽固醇傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)插圖均為在0～1.0×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)，相應(yīng)傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 雙酶?jìng)鞲衅鞯倪x擇性

尿酸（UA）和抗壞血酸（AA）是血清和腹腔巨噬細(xì)胞中的主要電活性小分子，可能會(huì)干擾傳感器對(duì)被分析物的測(cè)定，該文對(duì)此進(jìn)行了討論，如圖3所示。從圖中可以看出，連續(xù)交替加入20 μmol/L UA和20 μmol/L AA對(duì)葡萄糖傳感器和膽固醇傳感器都無(wú)明顯影響。該文還討論了雙電極之間的交叉干擾。在60 μmol/L UA和60 μmol/L AA的存在下，向溶液中先后連續(xù)加入0.5 mmol/L的膽固醇和葡萄糖，從圖3可以看出，膽固醇傳感器對(duì)膽固醇具有良好的電流響應(yīng)，對(duì)葡萄糖的加入無(wú)明顯響應(yīng)；同樣，葡萄糖傳感器對(duì)葡萄糖也有很好的響應(yīng)，對(duì)膽固醇無(wú)響應(yīng)。

1.4 實(shí)際樣品分析

該文利用建立的傳感器對(duì)大鼠血清及腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇進(jìn)行了同時(shí)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠血糖增加了229%，血膽固醇僅增加16%。而巨噬細(xì)胞內(nèi)，膽固醇和葡萄糖的含量均有明顯增加，其中葡萄糖含量增加了258%,膽固醇含量增加了113%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明糖尿病體內(nèi)高的葡萄糖含量會(huì)通過(guò)增加巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量，有可能進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。

圖3 雙酶?jìng)鞲衅鲗?duì) UA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、AA(20 μmol/L,40 μmol/L,60 μmol/L)、葡萄糖(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)和膽固醇(0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.3 mmol/L,0.4 mmol/L,0.5 mmol/L)的電流-時(shí)間響應(yīng)

表1 健康大鼠和糖尿病大鼠血清和巨噬細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖和膽固醇的含量

致謝:感謝國(guó)家自然科學(xué)基金 (21075041)和上海市科委納米專(zhuān)項(xiàng)基金(No.1052nm06500)提供的基金資助!

（略）