段曉燕，丁雯瑾，范建高，汪余勤

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200092

海狗油是來源于海豹科動(dòng)物海豹的脂肪油，富含ω-3多不飽和脂肪酸。我們前期的研究顯示，海狗油具有改善高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠模型糖脂代謝及脂肪細(xì)胞因子(包括脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素)表達(dá)的能力［1］。本研究在此基礎(chǔ)上，觀察海狗油對(duì)血清和肝組織半乳凝素3(Galectin 3，Gal 3)表達(dá)的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 8周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量140～160 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供;海狗油，天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司提供;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF α)和Gal 3 ELISA試劑盒分別購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司和上海玉博生物科技有限公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTMFirst strand cDNA Synthesis Kit)購自加拿大Fermentas公司;Real-time PCR反應(yīng)試劑(SYBRRPremix Ex TaqTM)購自大連TakaRa寶生物公司;DNA-marker 2000購自天根生化科技有限公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 動(dòng)物分組 24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體質(zhì)量層次用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組各8只。正常組喂普通飼料，模型組和海狗油組喂高脂飼料［2］(88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇)。實(shí)驗(yàn)第9周開始給予海狗油1.0 g/d，1次/d，共4周。模型組和正常組分別給予等量純凈水灌胃。12周后，隔夜禁食，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，稱體質(zhì)量，量體長(zhǎng)(鼻尖到尾根)，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(BMI=體質(zhì)量/體長(zhǎng)2);開胸心臟取血，開腹取肝，稱肝重，計(jì)算肝指數(shù)(肝濕重/體質(zhì)量 ×100%);常規(guī)制備血清、肝組織勻漿、石蠟切片并保留少量肝組織用于Gal 3 mRNA的檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法 (1)ELISA法檢測(cè)血清和肝勻漿Gal3、TNF α含量:按試劑盒操作說明進(jìn)行。(2)熒光定量PCR檢測(cè)肝組織Gal 3 mRNA表達(dá):按RNA抽提試劑盒提取總RNA;按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后按照熒光定量PCR試劑盒說明書以Sybr Green作為熒光標(biāo)記物，在IQ5熒光定量PCR儀(BIO-RAD)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物如下:Gal 3上游引物為5'-TAGCGGAGCGGCAGGAGGAG-3'，下游引物為5'-GGTTCCCCCATGCACCAGGC-3';3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物為5'-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3'，下 游 引 物 為 5'-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3'。熒光定量 PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后達(dá)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，94℃變性1 min，60℃退火1 min，之后每2個(gè)循環(huán)增加0.5℃，共69個(gè)循環(huán)。在同一實(shí)時(shí)定量中，所有樣品都是復(fù)管檢測(cè)。讀取管內(nèi)的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，繪制融解曲線。結(jié)果采用Ct值(某一基因擴(kuò)增達(dá)到所設(shè)定的熒光檢出界限值即閾值時(shí)所需的循環(huán)數(shù))作為評(píng)估基因表達(dá)量的指標(biāo)，Ct值越大，基因表達(dá)量就越小。以GAPDH基因作為內(nèi)參照。采用2－△△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量分析，ΔCt=Ct(目的基因)－Ct(管家基因 GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)－ΔCt(正常組)，所得結(jié)果為實(shí)驗(yàn)組中某基因表達(dá)量較對(duì)照組變化的倍數(shù)。(3)肝組織病理學(xué)檢查:石蠟切片，常規(guī)HE染色，200×光鏡下評(píng)估肝細(xì)胞脂變、炎癥和氣球樣變。肝細(xì)胞脂肪變:0分(＜5%)，1分(5% ～33%)，2分(34%～66%)，3分(＞66%);小葉內(nèi)炎癥(200倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶):0分(無)，1分(＜2個(gè))，2分(2～4個(gè))，3分(＞4個(gè));肝細(xì)胞氣球樣變:0分(無)，1分(少見)，2分(多見);三者組成NAFLD活動(dòng)度積分(NAS)。NAS＞4 分則可診斷 NASH［3］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料用表示，率的比較用Fisher確切概率法，多組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，參數(shù)間用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)指標(biāo)比較 與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、BMI、肝重和肝指數(shù)均明顯增加(P均＜0.01)，海狗油可顯著降低上述各項(xiàng)體質(zhì)指標(biāo)(BMI:P ＜0.05，其余指標(biāo) P 均 ＜0.01，見表1)。

表1 12周末3組大鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、BMI、肝重、肝指數(shù)比較()Tab 1 Comparison of body weight，body length，BMI，liver weight and liver index()

表1 12周末3組大鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)、BMI、肝重、肝指數(shù)比較()Tab 1 Comparison of body weight，body length，BMI，liver weight and liver index()

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.01，cP ＜0.05

組別 例數(shù) 體質(zhì)量(g) 體長(zhǎng)(cm) BMI(g/cm2) 肝重(g) 肝指數(shù)(g/kg)正常組 8 379.0 ±27.8 23.88 ±0.99 0.666 ±0.046 9.80 ±1.43 2.58 ±0.27模型組 8 531.6 ±36.6a 26.91 ±1.04a 0.734 ±0.030a 22.69 ±2.27a 4.27 ±0.35a海狗油組 8 439.6 ±52.6b 25.19 ±1.31b 0.691 ±0.028c 15.31 ±1.36b 3.52 ±0.48b

2.2 海狗油對(duì)大鼠血清和肝勻漿TNF-α、Gal-3含量的影響 模型組血清TNF-α以及血清和肝勻漿Gal-3含量均較對(duì)照組明顯升高(P均＜0.01);與模型組相比，海狗油可明顯降低上述各項(xiàng)指標(biāo)(P均＜0.05)，而肝組織TNF-α在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2)。

表2 12周末3組大鼠血清及肝勻漿TNF-α、Gal-3含量()Tab 2 The levels of TNF-α and galectin-3 in serum and liver by ELISA()

表2 12周末3組大鼠血清及肝勻漿TNF-α、Gal-3含量()Tab 2 The levels of TNF-α and galectin-3 in serum and liver by ELISA()

注:與正常組比較，aP ＜0.01;與模型組比較，bP ＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α(pg/mL)Serum Liver Gal 3(ng/mL)Serum Liver正常組816.55 ±2.73 4.29 ±1.41 9.28 ±0.97 17.89 ±1.36模型組 8 23.28 ±2.68a 5.62 ±2.13 13.92 ±1.68a 26.98 ±5.59a海狗油組 8 20.09 ±2.11b 5.01 ±1.88 11.84 ±1.67b 22.48 ±2.35b

2.3 海狗油對(duì)大鼠肝組織Gal-3 mRNA表達(dá)的影響

與正常組相比，高脂喂養(yǎng)顯著誘導(dǎo)模型大鼠肝臟Gal-3 mRNA 表達(dá)(1.562 ±0.278 vs 0.604 ±0.189，P＜0.01)，而海狗油顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠肝臟 Gal-3 mRNA 表達(dá)(1.115 ±0.332 vs 1.562 ±0.278，P ＜0.01)。

2.4 肝組織病理學(xué)變化 表3為12周末3組大鼠NAS積分，正常組無1例發(fā)生NASH;與模型組相比，海狗油組NASH發(fā)生率明顯低于模型組(87.5%vs 100%，P ＜0.01)。

表3 12周末3組大鼠肝細(xì)胞脂變、小葉內(nèi)炎癥、氣球樣變和NAS積分評(píng)估［例數(shù)(%)］Tab 3 Score assessment of steatosis，lobular inflammation，hepatocellular ballooning，and NAS in the 3 groups after 12 weeks［n(%)］

2.5 相關(guān)性分析 模型組肝組織Gal 3蛋白含量與肝重呈正相關(guān)(r=0.881，P ＜0.01)，其他各變量間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。

3 討論

本研究通過在普通飼料中添加2%膽固醇和10%豬油制備成的高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)SD大鼠12周后，所有大鼠發(fā)展為NASH，同時(shí)伴有肥胖和肝質(zhì)量的增加。以往研究顯示，此種造模方法在喂養(yǎng)8周后大鼠均發(fā)展為單純性脂肪肝［2］，而后者通常被認(rèn)為是一種可逆性病變，為防止疾病進(jìn)展，此階段常被作為治療的關(guān)鍵時(shí)期。目前尚無防治NASH的特效藥物，一些化學(xué)合成藥物和中草藥在防治NASH中有一定的功效，但由于不能完全排除一些毒副作用，使其應(yīng)用受限，近年來人們開始關(guān)注一些天然產(chǎn)品，海狗油正是其中之一。

人類飲食脂肪酸比例失調(diào)會(huì)導(dǎo)致脂肪肝，而現(xiàn)代西方化的飲食結(jié)構(gòu)往往使人們攝入過多的飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸的攝入?yún)s顯得不足。飲食中適當(dāng)增加不飽和脂肪酸，尤其是多不飽和脂肪酸(PUFAs)能改善代謝性疾病，包括NASH。富含ω-3 PUFAs的飲食有助于減輕肥胖者的體質(zhì)量，還可降低內(nèi)臟脂質(zhì)沉積，特別在減少脂肪肝患者肝臟脂質(zhì)沉積上有很好的功效。海狗油就是一種富含ω-3 PUFAs，但其對(duì)NASH治療作用的機(jī)制還不甚明了。Gal 3是晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)和脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物(ALEs)的重要受體，而后兩者在肝臟的積聚是脂肪肝進(jìn)展的重要原因［4］。脂肪細(xì)胞合成的Gal 3其基因缺陷可免于代謝性疾病相關(guān)性炎癥發(fā)生［5］。去除Gal 3可減輕致動(dòng)脈粥樣硬化飲食誘導(dǎo)小鼠NASH的發(fā)生，與減少肝臟ALEs積聚有關(guān)［6］。然而也有相反的研究［7］。盡管如此，已有文獻(xiàn)報(bào)道了Gal 3在人類肝病的誘導(dǎo)性表達(dá)［8］。本研究顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的NASH大鼠肝臟Gal 3基因和蛋白表達(dá)均顯著升高，而海狗油可降低其表達(dá)。另外高脂喂養(yǎng)大鼠血清Gal 3和TNFα均較對(duì)照組顯著升高，海狗油亦可顯著降低二者血清含量，然而肝TNFα在各組間未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;海狗油還可降低NASH發(fā)生率，證明其可延緩NASH進(jìn)展。有趣的是我們發(fā)現(xiàn)肝Gal 3含量與大鼠肝重呈顯著正相關(guān)。最近有研究顯示，NAFLD患者血清Gal 3水平與健康對(duì)照者無差異，但血清Gal 3與BMI呈中度正相關(guān)關(guān)系［9］。肥胖患者血清Gal 3水平是增加的［5］。

可見，海狗油對(duì)NASH的防治作用可能與其降低肥胖相關(guān)肝臟脂質(zhì)沉積有關(guān)，而后者的發(fā)生與機(jī)體Gal 3的異常表達(dá)有關(guān)。

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