陳 雷，王利娜，姜慧卿

1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內科，河北 石家莊 050000;2.河北省消化病實驗室;3.河北省消化病研究所;4.河北省人民醫(yī)院消化內科

肝硬化是一種全身性疾病，HPS是肝硬化晚期嚴重并發(fā)癥之一，其發(fā)病機制尚不清楚［1］。一氧化碳(carbon monoxide，CO)是一個潛在的血管舒張因子，而HO-1是合成內源性CO的關鍵酶。本研究采用CBDL大鼠制備HPS動物模型，觀察HO-1在肺組織的表達，探討其在HPS發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 HO-1多克隆抗體及HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京中山生物技術公司，RTPCR擴增系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備及取材:成年健康雄性Sprague Dawley大鼠共18只，體質量350～400 g，清潔級，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供(DK0410-0054)。動物飼養(yǎng)1周后，隨機分為3組:假手術組(sham operation，sham)、2周組和5周組，每組6只。3% 戊巴比妥鈉按0.1mL/100g體質量腹腔麻醉，sham組大鼠沿腹白線開腹后，分離膽總管，不結扎即關腹;2周組及5周組組用4號絲線分別在近肝門處和近十二指腸端雙線結扎膽總管后，從中段剪斷膽總管，術后2周及5周處理動物，用預先充盈肝素的1 mL注射器經腹主動脈抽血1 mL后，立即在血氣分析儀上進行檢測。取肝組織部分置40 g/L甲醛中固定，石蠟包埋，連續(xù)3 μm切片，行病理及免疫組化檢測，部分于液氮中保存，以備提取mRNA和蛋白質。

1.2.2 肝臟及肺臟組織學觀察:將甲醛固定好的肝臟、肺臟組織用石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色、MASSON染色，光鏡下觀察病理變化。

1.2.3 HO-1免疫組化染色:取肺組織以中性甲醛固定，石蠟包埋后切片常規(guī)脫蠟至水，胰酶修復抗原后依次滴加HO-1多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗、過氧化物酶標記的鏈霉親和素，以DAB顯色劑進行顯色反應，二甲苯透明，中性樹脂封片。光鏡下觀察結果。HO-1陽性產物呈棕色，與背景同色為陰性。

1.2.4 Western-blot檢測肺組織 HO-1 蛋白水平:取肺組織按照1∶2(m/V)加入組織提取液，冰浴超聲勻漿，15000 r/min 4℃離心5 min，取上清液進行乙醇沉淀。測定總蛋白量后，每孔加樣量為20 μg蛋白，然后進行SDS-PAGE分離，電轉移至PVDF膜，取出膜放到T-TBS(含50 g/L脫脂奶粉)室溫封閉2 h，然后T-TBS漂洗，加入HO-1多克隆抗體，4℃孵育過夜，T-TBS漂洗，再加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫2 h，最后加入顯色底物，室溫暗處顯色，TE緩沖液終止反應。

1.2.5 RT-PCR 檢測肺組織 HO-1 mRNA:以 Trizol提取肺組織總 RNA，取2 μg進行逆轉錄，反應體積為25 μL，41℃ 45 min;PCR:94℃預變性2 min進入循環(huán)，HO-1引物序列:5'CTG GAA GAG GAG ATA GAG CGA A 3'，5'TCT TAG CCT CTT CTG TCA CCC T 3'。內參照物β-actin引物序列:5'ACA GAG TAC TTG CGC TCA GGA G 3'，5'GTC ACC CAC ACT GTG CCCATC T 3'。取逆轉錄產物cDNA 6 μL進行PCR反應，反應總體積為20 μL，HO-1反應條件為94℃變性40 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，經35個循環(huán)擴增后72℃延伸10 min。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，并在紫外投射分析儀上對電泳條帶進行拍照。DNA分子量標準各片段大小分別為1000、800、600、400、300、200 bp。應用計算機分析系統(tǒng)對電泳條帶的寬度和亮度進行量化處理，以測量得到的HO-1/β-actin mRNA作為HO-1 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 動脈血氣分析 5周組動脈血氧(64.25±9.36)明顯降低，較 2 周組(87.23 ±10.42，P=0.00)與 sham組(92.23 ±9.12 mmHg，P=0.00)比較有顯著性差異。2周組與sham組動脈血氧均在正常范圍內。

2.2 肝臟病理 HE(見圖1)及Masson(見圖2)染色顯示，sham組肝小葉結構完整，肝板排列整齊。造模5周組肝臟廣泛結締組織增生，中央靜脈周圍出現膠原纖維沉積，肝小葉結構紊亂甚至形成假小葉。

2.3 肺臟病理 各組大鼠肺臟大小均正常，無肺水腫表現。5周組大鼠肺臟表面可見散在淤血斑點，HE染色顯示各組大鼠肺臟無炎性病變，sham組肺臟毛細血管無擴張，5周組毛細血管明顯擴張，管壁內皮細胞增生，管腔內可見較多紅細胞滯留，肺泡容量減小(見圖3)。A:sham組無明顯細胞外基質沉積;B:5周組大量細胞外基質沉積

圖1 肝組織病理染色(HE 100×)A:sham組正常肝小葉;B:5周組肝小葉結構紊亂 圖2 肝組織病理染色(Massson 100×)圖3 肺組織病理染色(HE 100×)A:sham組肺毛細血管無擴張;B:5周組毛細血管明顯擴張，管壁內皮細胞增生Fig 1 Histopathological changes in liver tissue(HE 100×)A:normal hepatic lobular in sham operation group;B:extensive ductular proliferation and ECM deposition after CBDL in 5 weeks group Fig 2 Histopathological changes in liver tissue(Massson trichome 100×)A:few ECM depositing in sham operation group;B:extensive connective tissue deposition after CBDL in 5 weeks group Fig 3 Histopathological changes in lung tissue(HE 100×)A:normal vascular in sham operation group;B:vascular dilatation after CBDL in 5 weeks group

2.4 肺組織HO-1免疫組織化學染色圖像 光鏡下觀察5周組大鼠肺組織中動脈和靜脈血管壁及內皮細胞、支氣管上皮及平滑肌細胞的胞漿內HO-1表達較高，2周組表達極低，sham組基本沒有表達，對照組無陽性表達(應用PBS代替一抗)(見圖4)。

2.5 Western-blot檢測肺組織HO-1蛋白表達 5周組HO-1蛋白表達與相應β-actin蛋白表達比值(1.22±0.18)明顯高于 2 周組(0.12 ±0.03，P=0.00)和sham 組(0.07 ±0.02，P=0.01)，sham 組和 2 周組無明顯差異(P=0.58，見圖5)。

2.6 肺組織HO-1 mRNA的表達 擴增得到的HO-1及內參照β-actin產物大小分別為438 bp、548 bp，結果顯示，5周組HO-1 mRNA 相對表達(1.84±0.17)明顯高于2 周組(0.77 ±0.22，P=0.00)和 sham 組(0.12 ±0.05，P=0.00)，2 周組明顯高于 sham 組(P=0.03，見圖6)。

3 討論

肝肺綜合征(HPS)是指肝功能不全引起肺血管擴張、非氣體交換障礙導致的低氧血癥及其一系列的病理生理變化和臨床表現。HPS三聯(lián)癥包括:慢性肝病;室內常氧條件下動脈血氧分壓(PaO2)下降或肺泡動脈氧分壓差(A-aDO2)增大;有肺內血管擴張的證據［2］。目前CBDL大鼠是唯一確定的具有人類HPS生理特征的動物模型［3］，本實驗從上述3方面驗證了CBDL能較好地復制HPS動物模型。肝肺綜合征發(fā)病機制尚不明確，肺血管擴張與收縮失衡，腸內細菌易位，腸源性內毒素血癥、肺單核-巨噬細胞激活及血管再生可能起重要作用［4］。HPS主要的病理生理特征是動脈低氧血癥。肺部血管的擴張是引起低氧血癥的重要原因，動脈氧分壓的改變直接反映了肺部損害的程度，對于判斷肝肺綜合征患者的病程和預后具有重要的意義。本實驗通過病理染色證實了肺毛細血管擴張的存在。慢性肝病特別是肝硬化門脈高壓時，肝細胞代謝功能低下，導致擴血管物質如前列腺素、血管活性腸肽、神經激肽A、降鈣素基因相關肽及P物質等滅活不能或產生過多，而縮血管物質如酪氨酸、5-羥色胺等減少或被抑制，導致肺內血管擴張。至于哪種物質在HPS發(fā)病中起直接作用尚不明確。

圖4 肺組織HO-1免疫組織化學染色(SP 200×)A:對照組;B:sham組;C:2周組;D:5周組Fig 4 Immunohistochemical location of HO-1 in lung tissue(SP 200×)A:control group;B:HO-1 expression in sham operation group;C:HO-1 expression in 2 weeks group lung after CBDL;D:HO-1 expression in 5 weeks group lung after CBDL

HO是血紅素降解的限速酶，可催化血紅素生成等摩爾的膽綠素、CO和鐵［5］。目前已知有3種HO同工酶:HO-1、HO-2及 HO-3。HO-1是誘導型，另外兩種為結構型［6］。內皮源性血管物質NO在HPS形成中的作用已經得到證實［7-8］。CO是與NO類似的介質，近年來逐漸受到重視。CO可作為信號分子通過cGMP介導血管擴張，并具有抗凋亡及抗炎作用［9-10］。內源性NO及CO在HPS發(fā)病機制中可能獨立或協(xié)同起作用［11］。

本研究結果顯示，HO-1蛋白及mRNA的表達在5周時表達明顯增加，這與Carter等［12-13］的研究一致。2周組HO-1mRNA明顯升高，但蛋白升高差異無統(tǒng)計學意義，我們認為，肝硬化對HO-1的調控是從基因水平開始的，其變化蛋白早于水平。HO-CO系統(tǒng)在肝硬化時被激活的機制尚不明確，有人報道在肝細胞壞死、纖維組織增生及假小葉形成、肝內血液循環(huán)紊亂、門脈壓力增加時常伴有內毒素血癥、NO合成增加、細胞因子增加，這些均可誘導HO-1的表達［14］。

HO-1在肝硬化多種組織與器官中表達均增多，HPS是肝硬化門脈高壓的肺部表現，HPS肺組織中HO-1的蛋白及基因水平增加體現了局部并發(fā)癥與原發(fā)疾病在發(fā)病機制上關聯(lián)及一致性。因此，我們推測HO-1表達增加導致CO增多，促進肺微血管擴張，可能是HPS發(fā)病機制之一。

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