李飛飛，黃佳斌，陳 珍，陳 彤，鮑思偉

（臺(tái)州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000）

日本薯蕷（Dioscorea japonica Thunb.）別名尖葉薯蕷，又名野山藥，根莖中提取的薯蕷皂甙元（通稱薯蕷皂素）是合成性激素和甾體類(lèi)激素的重要原料，廣泛用于治療癌癥、心腦血管疾病、呼吸道疾病等，也可作為避孕藥物等［1，2］。日本薯蕷生長(zhǎng)于向陽(yáng)山坡的灌叢中或林下，分布于西南、華南、華中、華東各地。由于薯蕷屬植物的藥用價(jià)值高，在醫(yī)藥生產(chǎn)過(guò)程中原料需求量大而導(dǎo)致過(guò)度采挖，以致野生資源瀕臨枯竭。薯蕷地下根莖的自然恢復(fù)需要3～5年，且其種子的萌發(fā)比較困難，在自然狀況下僅1%左右的種子能夠成苗，生產(chǎn)原料的供需矛盾十分突出［3-5］。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)日本薯蕷的快速繁殖，有望解決上述問(wèn)題。作者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，日本薯蕷在浙江臺(tái)州的天臺(tái)、臨海等縣市的山區(qū)有廣泛分布。為開(kāi)發(fā)利用本地中藥材資源，我們開(kāi)展了日本薯蕷的組培快繁研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

日本薯蕷（Dioscorea japonica Thunb.）采自浙江省天臺(tái)縣華頂山。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料的消毒

春季，剪取日本薯蕷當(dāng)年生植株，用洗潔精清洗后流水沖洗約30 min。轉(zhuǎn)置超凈工作臺(tái)進(jìn)行植株表面消毒，75%酒精漂洗30 s，無(wú)菌水沖洗3～4次，再投入到0.1%升汞溶液中浸泡10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，切取帶節(jié)莖段為外植體，接種至各種固體培養(yǎng)基上（添加活性炭0.15%，蔗糖3%）（表1）。

1.2.2 塊莖誘導(dǎo)

切取單個(gè)芽接種至附加細(xì)胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤 （6-BA）1.0 mg/L和生長(zhǎng)素α-萘乙酸（NAA）0.1 mg/L及活性炭（AC）0.15%與蔗糖3%的MS基本培養(yǎng)基中，觀察根和塊莖的誘導(dǎo)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)日本薯蕷不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響

將日本薯蕷的無(wú)菌帶節(jié)莖段接種于表1所列的培養(yǎng)基中，5～6 d后能看到芽點(diǎn)萌動(dòng)，10 d后能明顯看出所選培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)腋芽的萌發(fā)，14 d后在不同培養(yǎng)基中的外植體長(zhǎng)勢(shì)逐漸出現(xiàn)差異，20 d后外植體在含有激素的培養(yǎng)基中形成叢生芽（圖1）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素6-BA濃度在1.0～2.0 mg/L，生長(zhǎng)素NAA濃度在0.2～1.0 mg/L時(shí)，均能誘導(dǎo)叢生芽，葉片顏色濃綠，苗健壯。當(dāng)NAA濃度相同時(shí)，芽萌發(fā)數(shù)隨著6-BA濃度的升高而增多，但芽萌動(dòng)時(shí)間相對(duì)較遲；當(dāng)6-BA濃度都為2.0 mg/L時(shí)，NAA為0.5 mg/L芽的誘導(dǎo)率和增殖率都最高。因此可選用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+AC 0.15%為日本薯蕷不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基。

表1 不同濃度6-BA和NAA對(duì)日本薯蕷不定芽誘導(dǎo)和增殖的影響Table 1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the induction and multiplication of bud of Dioscorea japonica

圖2 日本薯蕷的生根培養(yǎng)Fig.2 Formation of adventitious root of Dioscorea japonica

2.2 日本薯蕷根和塊莖的誘導(dǎo)

切取叢生芽接種至MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋AC0.15%的培養(yǎng)基中，半個(gè)月后可誘導(dǎo)生根（圖2）。繼續(xù)培養(yǎng)至2～3個(gè)月，靠近培養(yǎng)基的節(jié)間也生出不定根，同時(shí)在基部誘導(dǎo)形成塊莖（圖3和圖4）。

圖3 日本薯蕷的生長(zhǎng)和塊莖的誘導(dǎo)Fig.3 Growth and tuber induction of Dioscorea japonica

圖4 日本薯蕷組培條件下誘導(dǎo)的塊莖Fig.4 Tuber of Dioscorea japonica from tissue culture

3 小結(jié)與討論

薯蕷是重要的經(jīng)濟(jì)植物，所含薯蕷皂甙元具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，被廣泛用于醫(yī)藥、食品和衛(wèi)生保健等方面。隨著甾體激素類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)薯蕷皂素的需求量不斷增加，薯蕷市場(chǎng)的供需矛盾十分突出。一些重要薯蕷，如穿龍薯蕷、菊葉薯蕷、盾葉薯蕷等，通過(guò)葉片、葉柄、莖段、胚乳等外植體進(jìn)行的組織培養(yǎng)已經(jīng)繁殖成功［6-10］，但日本薯蕷的離體快繁及微塊莖的誘導(dǎo)還有待研究。為更好地開(kāi)發(fā)利用本地中藥材，本研究小組選擇日本薯蕷的葉片和葉柄成功誘導(dǎo)了愈傷組織，不定芽的分化還在繼續(xù)研究中。

莖段外植體較易誘導(dǎo)腋芽的萌發(fā)和不定芽的增殖。黃鳳翔等［11］的研究結(jié)果表明，與6-BA相比，6-糠氨基嘌呤（激動(dòng)素，KT）對(duì)菊葉薯蕷外植體誘導(dǎo)效果較差。因此本文以細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA的組合來(lái)試驗(yàn)其對(duì)日本薯蕷不定芽形成與增殖的影響，結(jié)果表明低濃度的6-BA能啟動(dòng)不定芽的形成，但增殖系數(shù)不高；隨著其濃度的增加，叢生芽系數(shù)增加；但濃度過(guò)高則又抑制芽的增殖和莖葉的生長(zhǎng)。這與李光明和劉文海［5］、黃鳳翔等［11］和陳鳳清等［12］在盾葉薯蕷、菊葉薯蕷和穿龍薯蕷等的組培快繁優(yōu)化研究時(shí)的發(fā)現(xiàn)均一致。生長(zhǎng)素濃度過(guò)高容易導(dǎo)致細(xì)胞和液泡較大而不利再生苗的誘導(dǎo)［12］。本實(shí)驗(yàn)也觀察到中低濃度的NAA更適合日本薯蕷叢生芽的生長(zhǎng)?；钚蕴磕芪脚囵B(yǎng)基中的有害物質(zhì)，包括瓊脂中的雜質(zhì)、培養(yǎng)物分泌的酚、醌類(lèi)物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時(shí)產(chǎn)生的5-羥甲基糠醛等，從而有利于外植體的生長(zhǎng)。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)活性炭的添加有利于薯蕷不定芽的增殖和塊莖的誘導(dǎo)。

同時(shí)我們首次在實(shí)驗(yàn)中獲得了微塊莖，為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量繁殖日本薯蕷塊莖奠定了基礎(chǔ)。研究表明調(diào)節(jié)激素種類(lèi)和比例、提高蔗糖含量、改變光照、添加矮壯素（CCC）或者多效唑（PP333）等均可提高薯蕷、半夏等塊莖或試管姜及試管薯的產(chǎn)量［13-16］。進(jìn)一步試驗(yàn)日本薯蕷塊莖誘導(dǎo)的最佳條件，可縮短誘導(dǎo)時(shí)間和提高產(chǎn)量和質(zhì)量。

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