張 才，郝貴增，王亞壘，白 刃，尚澤松，楊自軍

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003;2.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南安陽(yáng)455000;3.沈陽(yáng)市沈北新區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生管理局，遼寧沈陽(yáng)110121)

0 前言

鉬是動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行正常生命活動(dòng)不可缺少的必需微量元素之一［1］，是動(dòng)物體內(nèi)醛氧化酶、亞硫酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶等多種酶的活性組分。在人體中，鉬缺乏很少見;在動(dòng)物中，鉬缺乏所表現(xiàn)出的癥狀主要是生長(zhǎng)遲緩和生殖障礙［2-3］。與鉬缺乏相比，鉬中毒更為常見，反芻動(dòng)物比單胃動(dòng)物更敏感。1938年，F(xiàn)erguson首次報(bào)道牧草中鉬含量過高可使放牧牛產(chǎn)生以劇烈腹瀉為特征癥狀的中毒病，自此人們一直認(rèn)為鉬是有毒物質(zhì)。中國(guó)江西省、陜西省、河南省等地也有鉬中毒的報(bào)道。直到1953年，Richert等研究證明鉬是黃嘌呤氧化酶的組成成分，并與該酶的活性密切相關(guān)后，才確認(rèn)鉬是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)必需的微量元素。

自然界中鉬無處不在，食物和飲水中均能檢測(cè)出鉬。鉬在工業(yè)生產(chǎn)中的用途十分廣泛，電子產(chǎn)品、玻璃、陶瓷、潤(rùn)滑劑的制造，催化劑和顏料的生產(chǎn)，冶金業(yè)以及醫(yī)院化學(xué)試劑的使用過程中，都要用到鉬［4］。因此，在鉬礦附近地區(qū)或某些行業(yè)中人們可能接觸到高濃度的鉬。雖然目前還沒有關(guān)于高鉬對(duì)人類毒性作用的直接證據(jù)，但在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，血液中鉬的濃度與精子密度降低、正常形態(tài)數(shù)目減少存在相關(guān)［3］，這一結(jié)果與在動(dòng)物上的研究結(jié)果十分接近［5-6］。

為探討鉬暴露對(duì)動(dòng)物的生殖毒性，本文利用毒理學(xué)的原理和試驗(yàn)方法，建立小鼠鉬暴露模型，通過鉬暴露條件下小鼠繁殖試驗(yàn)觀察鉬對(duì)小鼠生殖功能的影響，為探尋高鉬對(duì)小鼠生殖能力的影響提供基本的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

60日齡的清潔級(jí)ICR小鼠60只(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.1.2 試驗(yàn)日糧配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))

玉米27.0%，豆餅16.0%，魚粉13.0%，鈣粉3.0%，骨粉3.0%，維生素0.1%，微量元素0.1%，大米16.0%，食鹽0.5%，酵母粉2.3%，麩皮19.0%。

1.1.3 試劑

FSH診斷試劑盒(批號(hào):20081208)，雌激素診斷試劑盒(批號(hào):20081106)，睪酮診斷試劑盒(批號(hào):20081208)均購(gòu)自北京泰格科信公司。其他均為普通生化試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

40只雌性和20只雄性小白鼠(60日齡)，隨機(jī)分成4組，每組10只雌性和5只雄性小白鼠，雌雄分籠飼養(yǎng)，自由采食，基礎(chǔ)日糧相同，通過在飲水中加入不同劑量的鉬(Na2MoO4·2H2O形式)建立試驗(yàn)動(dòng)物模型:空白對(duì)照組、低鉬組(100 mg/L)、中鉬組(200 mg/L)和高鉬組(400 mg/L)，4周后雌雄合籠飼養(yǎng)。產(chǎn)仔后從每組仔鼠中隨機(jī)選取30只雌性小白鼠和15只雄性小白鼠按原分組給予不同劑量的鉬，8周后，再?gòu)拿拷M中隨機(jī)選取10只雌性小白鼠和5只雄性小白鼠合籠飼養(yǎng)，測(cè)定其產(chǎn)仔數(shù)。如此往復(fù)，使小鼠繁殖4代，記錄分娩率和每胎產(chǎn)仔數(shù)。其余小鼠用摘眼球采血法采血后處死，取睪丸和附睪等用于試驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定和方法

小鼠繁殖能力測(cè)定:記錄每組小鼠的分娩率和每只妊娠小鼠的產(chǎn)仔數(shù)。

生精功能檢測(cè):(1)睪丸細(xì)胞微核的觀察:一般采用常規(guī)微核實(shí)驗(yàn)法［7］。微核率按下式計(jì)算:睪丸微核率=(出現(xiàn)微核的睪丸細(xì)胞數(shù)/檢查的睪丸細(xì)胞總數(shù))。(2)精子畸形率測(cè)定:主要是通過精子的形態(tài)觀察，計(jì)算不正常的精子占總精子數(shù)的百分率來判斷精液的質(zhì)量。取小鼠附睪，將其置于1 mL生理鹽水中，剪碎，制成精子懸液。經(jīng)抹片、固定、染色后，將載玻片放在400×的顯微鏡下進(jìn)行觀察，共記錄若干個(gè)視野內(nèi)的精子(每個(gè)涂片至少觀察200個(gè)精子)。下列精子可被視為畸形精子:頭部膨大、尾部膨大、雙頭、雙尾、頸部折回、尾部折回、尾部卷曲、斷尾、缺頭、缺尾等。

1.2.3 血清中性激素水平的測(cè)定

采用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(北京泰格科信MP280 CLIA)測(cè)定血清中的性激素水平，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(精確概率法)。

2 結(jié)果

2.1 鉬對(duì)小鼠各代分娩率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

鉬對(duì)小鼠各代分娩率和產(chǎn)仔數(shù)的影響見表1，F(xiàn)0為第1代，F(xiàn)1為第2代，F(xiàn)2為第3代，F(xiàn)3為第4代。隨著小鼠在鉬暴露條件下時(shí)間的延長(zhǎng)，高劑量的鉬表現(xiàn)出一定的生殖毒性，F(xiàn)1代小鼠分娩率與其他組相比達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)，而F2代10只雌鼠全部出現(xiàn)了不孕的現(xiàn)象，小鼠分娩率與其他組相比則達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。各代小鼠在每胎平均產(chǎn)仔數(shù)上差異不顯著(P＞0.05)。

表1 鉬對(duì)小鼠各代繁殖率和產(chǎn)仔數(shù)的影響

2.2 鉬對(duì)F1代小鼠精液質(zhì)量的影響

鉬對(duì)F1代小鼠精液質(zhì)量的影響見表2，除低鉬組外，試驗(yàn)組和對(duì)照組相比，F(xiàn)1代小白鼠睪丸細(xì)胞微核率有所增高，高鉬組小鼠睪丸細(xì)胞微核率顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，隨著鉬劑量的增加，試驗(yàn)各組小鼠精子畸形率呈上升趨勢(shì)，至高鉬組達(dá)到最大值，高鉬組與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05);試驗(yàn)各組小鼠精子密度逐漸降低，至高鉬組達(dá)到最小值，高鉬組與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)。

2.3 鉬對(duì)F1代小鼠生殖激素的影響

鉬對(duì)F1代小鼠生殖激素的影響見表3，由表3可知:隨著鉬劑量的增加，雄性小鼠睪酮濃度逐漸降低，至高鉬組達(dá)到最小值，組間差異顯著(P＜0.05)，鉬對(duì)雄性小鼠卵泡刺激素的水平影響不明顯，而低鉬組對(duì)雌性小鼠卵泡刺激素有顯著的提高作用(P＜0.05)。

表2 鉬對(duì)F1代小鼠精液的影響

表3 鉬對(duì)F1代小鼠生殖激素的影響

3 討論與結(jié)論

外源化學(xué)物對(duì)生殖過程作用的評(píng)定主要通過生殖毒性試驗(yàn)來進(jìn)行。本研究在3代2窩生殖毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上延長(zhǎng)了攻毒時(shí)間，增加了繁殖代數(shù)，這對(duì)于研究長(zhǎng)期高鉬暴露對(duì)小鼠的生殖毒性更有借鑒意義。試驗(yàn)結(jié)果表明:長(zhǎng)期暴露在高鉬條件下可導(dǎo)致小鼠后代的繁殖障礙。試驗(yàn)中暴露在400 mg/L飲水條件下的小鼠，當(dāng)其繁殖到第2窩第3代時(shí)，表現(xiàn)出一定繁殖障礙，至第3窩第4代時(shí)則出現(xiàn)了全面的繁殖障礙。除了發(fā)現(xiàn)高劑量的鉬可引起一定的生殖毒性外，文獻(xiàn)［9］給小鼠飼喂含10～500 mg/d的鉬酸銨飼料232 d，結(jié)果觀察到了較為明顯的中毒體征，文獻(xiàn)［10］也觀察到40 mg/kg體重飼喂的小鼠可以引起母鼠體重減少，胎鼠體重降低和胎鼠骨骼發(fā)育障礙，關(guān)節(jié)腫脹，變性等中毒體征。這些均未在本試驗(yàn)中觀察到，這可能是由于攻毒方式、時(shí)間和劑量不同造成的。本試驗(yàn)雖然攻毒時(shí)間較長(zhǎng)，但攻毒方式為自由飲水，鉬的濃度也相對(duì)較低，故小鼠實(shí)際攝入鉬的水平不如前者高。

精子是雄性動(dòng)物生殖的基礎(chǔ)，精子的畸變和數(shù)量的降低將極大地降低雄性個(gè)體的生殖機(jī)能，且具有一定潛在的遺傳危害。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):隨著鉬濃度的提高，小鼠睪丸組織細(xì)胞的微核率，精子畸形率逐漸提高，高鉬組與對(duì)照組存在顯著差異，同時(shí)精子數(shù)量逐漸降低。這與文獻(xiàn)［5］的研究結(jié)果一致。

鉬可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，且這種促進(jìn)作用的大小與給鉬量(濃度)呈正相關(guān)。另外，過量的鉬也可抑制超氧化物歧化酶、黃嘌呤氧化酶等相關(guān)酶的活性，從而影響細(xì)胞的正常代謝［11］。在細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞代謝異常導(dǎo)致細(xì)胞微核率上升，這或許是鉬中毒引起小鼠睪丸細(xì)胞微核率升高、精子畸形，進(jìn)而引起精子數(shù)量下降的主要原因。

動(dòng)物生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持受到下丘腦—垂體—性腺軸的調(diào)控，其中生殖激素發(fā)揮了十分重要的作用。鉬可調(diào)控激素水平，文獻(xiàn)［12］的研究表明循環(huán)血液中睪酮水平與血清鉬含量負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果提示高鉬不能降低雄性小鼠卵泡刺激素的分泌，但可抑制睪酮的合成，使睪酮水平下降，這可能是由于高鉬造成睪丸組織的損傷，進(jìn)而影響了睪酮的合成。同時(shí)，對(duì)雌鼠激素水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低鉬組提高了雌性小鼠卵泡刺激素的水平。提示低濃度的鉬能提高雌性小鼠的生殖功能。鉬是必需微量元素，其對(duì)機(jī)體是產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)作用還是毒性作用的關(guān)鍵是鉬的攝入量。

試驗(yàn)表明:高鉬暴露具有生殖毒性，長(zhǎng)期高鉬條件下可導(dǎo)致小鼠分娩率的下降，雄性小鼠精子質(zhì)量的降低。

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