尚 靜，房 寧，滕思瑩，崔香艷，汪 欣

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科，吉林 長春 130021)

腫瘤轉(zhuǎn)移表現(xiàn)為細(xì)胞脫落、細(xì)胞遷移、降解細(xì)胞外基質(zhì)、新生血管形成等級聯(lián)反應(yīng)，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表現(xiàn)出的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，即細(xì)胞黏附的喪失和遷移力的獲得作為腫瘤轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)的起始環(huán)節(jié)越來越受到學(xué)者們的重視。上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)是鈣黏附素中的一個重要成員，其下調(diào)常標(biāo)志著EMT的發(fā)生。E-cadherin介導(dǎo)同型細(xì)胞間的連接，維持正常上皮細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞的極性以及組織結(jié)構(gòu)的完整性[1]。當(dāng)上皮細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞間的黏附性下降，細(xì)胞就從原發(fā)部位脫落，若此過程發(fā)生在上皮性腫瘤中就可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步[2]。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過與E-cadherin啟動子區(qū)E-box盒結(jié)合來抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄[3]，降低E-cadherin蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞從相鄰細(xì)胞脫落并遷移。Snail高表達(dá)于乳腺癌[4]、胃癌[5]、結(jié)腸癌[6]、肝癌[7]、食管癌[8]等組織中，并與乳腺癌、胃癌、食管癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5,8]。然而Snail在喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)組織中的表達(dá)國內(nèi)未見報道，國外也少有研究。本研究旨在分析LSCC組織中Snail和E-cadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化的關(guān)系，探討EMT與LSCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集吉林大學(xué)第一醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科2008年3月-2009年11月手術(shù)切除經(jīng)病理證實為鱗狀細(xì)胞癌的LSCC組織46例，相應(yīng)手術(shù)切除范圍外經(jīng)病理證實為正常鱗狀上皮的癌旁組織46例。所有患者術(shù)前未進(jìn)行化療和放療。46例喉癌標(biāo)本中男性32例，女性14例；年齡38～80歲，平均年齡58.62歲(年齡≤59歲25例，年齡>59歲21例)；發(fā)病部位：聲門上型30例，聲門型16例；按國際抗癌協(xié)會(UICC)的TNM分類標(biāo)準(zhǔn)(2002)分別為T1-T224例，T3-T422例；臨床分期Ⅰ-Ⅱ期12例，Ⅲ-Ⅳ期34例；有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例，無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例；按組織學(xué)分級：高分化13例，中分化20例，低分化13例。

1.2 主要試劑及步驟小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體(MAB-0589)(即用型)，超敏S-P免疫組化試劑盒(KZT9710)，小鼠抗人Snail單克隆抗體(bs-1371R)。石蠟切片脫蠟、水化、修復(fù)后，滴加一抗(小鼠抗人Snail單克隆抗體稀釋度為1∶100，小鼠抗人E-cadherin單克隆抗體稀釋度為1∶200)，4℃過夜，以PBS代替一抗作為陰性對照。滴加二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈酶親和素-生物素-辣根過氧化物酶，DAB顯色和蘇木精復(fù)染色，脫水和透明后用中性樹膠封片。

1.3 結(jié)果判斷Snail及E-cadherin表達(dá)的免疫組化結(jié)果判定方法：每張切片在100倍視野找到表達(dá)密集區(qū)，200倍下計數(shù)3個視野、200個細(xì)胞。染色結(jié)果綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分析，染色強(qiáng)度積分分值(IRS)=SI×PP，SI表示染色強(qiáng)度，無染色為0分，弱染色為1，中等染色為2，強(qiáng)染色為3；PP是陽性細(xì)胞百分比，陽性率0記為0分，<10% 為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。按照積分分值分為：陰性(—)，0～1分；弱陽性(+)，2～3分；中度陽性()，4～6分；強(qiáng)陽性()，>6分。弱陽性、中度陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)合稱為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Snail和E-cadherin在LSCC、癌旁組織中表達(dá)陽性率比較，以及兩者在LSCC中的表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系，均采用χ2檢驗；Snail和E-cadherin在LSCC中表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 Snail在LSCC和癌旁組織中的表達(dá)Snail表達(dá)可見于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒彌漫分布于細(xì)胞漿或棕褐色顆粒分布于細(xì)胞核內(nèi)。在LSCC組織中，Snail表達(dá)多為陽性或強(qiáng)陽性，多數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)(圖1A～C，見插頁四)；在癌旁組織中，Snail表達(dá)主要為陰性和弱陽性，陽性多位于細(xì)胞漿區(qū)域，少數(shù)細(xì)胞核染成棕褐色(圖1D，見插頁四)。LSCC和癌旁組織中Snail表達(dá)的陽性率分別為69.57%(32/46)和36.96%(17/46)。Snail在LSCC與癌旁組織表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.824 4，P<0.01)。

2.2 Snail的表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系在不同年齡組、不同性別組、不同發(fā)病部位組、不同T分級組以及不同臨床分期組Snail表達(dá)陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而在LSCC的不同組織分化程度組、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，Snail表達(dá)陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在不同組織分化組中，Snail的表達(dá)程度隨組織分化程度的降低而逐漸增強(qiáng)，且其表達(dá)部位由以細(xì)胞質(zhì)染色為主到以細(xì)胞核染色為主(圖1A～C，見插頁四)，Snail在高分化、中分化、低分化組中的陽性率分別為46.15%、64.71%和93.75%，低分化組Snail表達(dá)陽性率與高分化組、中分化組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而高分化組與中分化組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 E-cadherin在LSCC和癌旁組織中的表達(dá)E-cadherin表達(dá)的陽性細(xì)胞為棕黃色顆粒沿細(xì)胞膜彌漫分布或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見棕黃色顆粒。在LSCC組織中，E-cadherin表達(dá)多為陰性和弱陽性，陽性多位于細(xì)胞膜區(qū)域，少數(shù)細(xì)胞質(zhì)染色，但棕黃色顆粒分布不均勻(圖2A～C，見封三)。在癌旁組織中，E-cadherin表達(dá)多為陽性或強(qiáng)陽性，多數(shù)均勻分布于細(xì)胞膜，少數(shù)可見細(xì)胞質(zhì)染色(圖2D，見封三)。LSCC和癌旁組織中E-cadherin表達(dá)陽性率分別為47.83%(22/46)和78.26%(36/46)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.144 0，P<0.01)。

2.4 E-cadherin的表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系在不同年齡組、不同性別組和不同發(fā)病部位組E-cadherin表達(dá)陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而在LSCC的不同T分級組、不同組織分化程度組、不同臨床分期組、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，E-cadherin表達(dá)陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在不同組織分化組中，E-cadherin的表達(dá)程度隨組織分化程度的降低而逐漸降低，表達(dá)部位由以細(xì)胞膜染色為主到以細(xì)胞質(zhì)染色為主，在低分化組織中大部分組織未見染色，只見少部分細(xì)胞漿染色(圖2A～C，見封三)，E-cadherin在高、中、低組織分化組中的陽性率分別為69.23%、58.82%和18.75%，低分化組E-cadherin表達(dá)陽性率與高分化組、中分化組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而中分化組與低分化組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 Snail和E-cadherin的表達(dá)與LSCC臨床病理特征的關(guān)系

2.5 Snail和E-cadherin在LSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，Snail的陽性表達(dá)增高，E-cadherin的陽性表達(dá)明顯減弱，兩者在LSCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.569 0，P<0.01)。

3 討 論

正常上皮依靠細(xì)胞間的黏附作用來建立和維持組織細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，如果這種黏附作用出現(xiàn)異常，將會導(dǎo)致細(xì)胞的堆積、去分化，甚至侵襲和轉(zhuǎn)移，形成惡性腫瘤。鈣黏蛋白是細(xì)胞黏附分子中的一個家族，其中E-cadherin在維持正常上皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性及在組織結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮著重要作用[1]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)：在轉(zhuǎn)移潛能低、分化較好的細(xì)胞如正常上皮細(xì)胞MDCK、上皮性腫瘤細(xì)胞A431、MCF27、MDA2MB453中均存在較強(qiáng)的E-cadherin mRNA與蛋白的表達(dá);而在轉(zhuǎn)移潛能高的成纖維細(xì)胞3T3、低分化的上皮性癌細(xì)胞HepG2、MDA-MB435s、MDA-MB231中，E-cadherin的mRNA與蛋白幾乎檢測不到。本研究結(jié)果顯示：在低分化LSCC組織中E-cadherin的表達(dá)幾乎為陰性，只在少許細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中見弱表達(dá)，未見細(xì)胞膜表達(dá)，這可能是因為此時的E-cadherin蛋白雖有合成，但不能與細(xì)胞膜結(jié)合發(fā)揮其應(yīng)有的黏附功能，使細(xì)胞黏附力下降，再次支持了EMT通過降低E-cadherin的方式促進(jìn)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和浸潤。Snail屬于轉(zhuǎn)錄抑制子中的Snail家族，在EMT的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中居于中心環(huán)節(jié)。研究[10]表明：Snail不僅調(diào)控E-cadherin蛋白，還轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種在EMT中發(fā)揮作用的蛋白，從而被認(rèn)為是一種重要的腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子。體外實驗將反義Snail轉(zhuǎn)染入卵巢癌細(xì)胞HO9810[10]、肝癌HepG2[11]和鼻咽癌5-8F細(xì)胞[12]，可以顯著降低上述癌細(xì)胞的運動能力，同時其侵襲細(xì)胞外基質(zhì)的能力也明顯下降，從而明顯降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。

臨床多項研究表明:Snail和E-cadherin在很多上皮性癌(包括鱗癌、肝癌、黑色素瘤等)中存在明顯的反向表達(dá)。在這些研究中還發(fā)現(xiàn)侵襲力強(qiáng)的E-cadherin陰性克隆細(xì)胞呈現(xiàn)Snail的高表達(dá)，而侵襲力弱的E-cadherin陽性克隆細(xì)胞幾乎檢測不到Snail的表達(dá)。研究[13]發(fā)現(xiàn)：在卵巢癌早期Snail在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均表達(dá)，而在腫瘤晚期和轉(zhuǎn)移階段Snail單獨定位于細(xì)胞核，此外Snail的表達(dá)水平和細(xì)胞定位與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在本研究中，Snail在高分化LSCC組織中細(xì)胞核染色較少，以細(xì)胞質(zhì)染色為主，但在中分化LSCC組織中細(xì)胞核染色逐漸增多，但染色程度較低分化組織弱，而在低分化LSCC組織中則以細(xì)胞核的強(qiáng)染色為主。而E-cadherin的表達(dá)則與Snail相反。說明在LSCC組織中Snail和E-cadherin存在反向表達(dá)。

Snail的表達(dá)強(qiáng)度與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，E-cadherin的表達(dá)程度除與組織分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)外，還與腫瘤TNM分級和臨床分期相關(guān)，考慮可能是在LSCC組織中E-cadherin除受到Snail的調(diào)控外，還可能受到其他因子的調(diào)控。研究[14]發(fā)現(xiàn)：無論是在mRNA水平還是在蛋白水平，轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail、Slug、SIP1和Twist在梭狀細(xì)胞癌中的表達(dá)均高于鱗狀細(xì)胞癌，Slug、Twist和SIP1的增高具有統(tǒng)計學(xué)意義，而Snail無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，Snail表達(dá)越強(qiáng)、E-cadherin表達(dá)越弱，LSCC就越有可能發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度越差。因此Snail和E-cadherin聯(lián)合檢測可作為判斷LSCC惡性程度和預(yù)后的參考指標(biāo)，并能為個性化治療提供參考信息。

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