遲長亮，蘆志華，管旌旌，王 勇，唐宇哲，蔡 勇，金景姬，王春喜

(1.吉林大學第一醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春 130021；2.吉林省人民醫(yī)院泌尿外科，吉林 長春 130021；

3.吉林大學生命科學學院表觀遺傳學實驗室，吉林 長春 130012)

組蛋白乙酰化修飾在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷修復及細胞周期調(diào)控等生物學過程中發(fā)揮重要作用，是近年來表觀遺傳學、腫瘤學領(lǐng)域的研究熱點。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl-transferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDACs)是調(diào)控組蛋白乙?；揎椀?種重要的酶。組蛋白乙?；竓MOF是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶家族的成員之一，負責組蛋白H4的第16位賴氨酸(H4K16)的乙?；?。其表達量的減少將導致整個基因組組蛋白H4K16乙?；降南陆?，引起基因組的蛋白表達發(fā)生改變[1]。目前研究[2]表明：hMOF表達量的異常與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度相關(guān)。腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病機制一直是研究的熱點。目前有關(guān)hMOF蛋白與腎癌發(fā)病機制的研究國內(nèi)外尚無相關(guān)報道，本文作者通過研究hMOF蛋白在腎癌組織中的表達情況，探討其在腎癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應

1.1.1 標本及主要試劑 收集近期本院行腎癌根治術(shù)的癌組織標本9例，其中Fuhrman分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級各3例，并留取癌旁正常腎組織作為對照。主要試劑及儀器：superRT cDNA 試劑盒(CWbio公司)。Tiozol RNA 試劑盒(Biomiga公司)。hMOF及β-actin基因PCR引物，hMOF基因上游引物5′-GAAGTCACGGTGGAGATCGGA-3′，下游引物5′-CTTGGCCAGCAGACACAGGTT-3′；β-actin基因上游引物5′-ATGGGTCAGAAGGATTCCTATGT-3′，下游引物5′-AGCCACACGCAGCTCATT-3′(上海生工生物技術(shù)公司合成)。熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7300)。

1.1.2 方法 組織樣本留取后迅速用液氮冷凍保存。采用Tiozol RNA 試劑盒提取組織總RNA，并測定含量。用superRT cDNA 試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存待用。采用SYBER Green嵌合熒光法擴增目的基因和內(nèi)參基因。qRT-PCR體系如下：SYBR Green 12.5 μL，dH2O 4.5 μL，上、下游引物各2 μL(2 mmol·L-1)，cDNA模板4 μL(2 mg·L-1)。反應條件：預變性，95℃、30 s；PCR擴增，95℃、5 s，64℃、20 s，40個循環(huán)；融解曲線分析：95℃、0 s，65℃、15 s，95℃、0 s；退火：60℃。實驗數(shù)據(jù)應用2-△△Ct進行處理，其前提是目的基因和內(nèi)參基因擴增率一致[3]。每個樣本重復進行3次實驗，計算各樣本平均Ct(threshold cycle number)值和ΔCt值(ΔCt=Ct目標組-Ct對照組)，計算2-△△Ct,2-△△Ct=2-(△Ct目標組-△Ct對照組)，其數(shù)值表示目的基因表達值相對于參照表達值的相對倍數(shù)。

1.2 免疫組織化學

1.2.1 一般資料 選取吉林大學第一醫(yī)院泌尿外科2007年1月—2010年1月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的RCC標本66例，其中男性43例，女性23例，年齡29～83歲，平均年齡56歲。病理分期采用2002年AJCC腎癌分期系統(tǒng)分為：pT1 18例，pT2 24例，pT3 17例，pT4 7例；組織學分級采用Furhman標準分級：Ⅰ級22例,Ⅱ級22例,Ⅲ級22例，所有患者術(shù)前均為原發(fā)腎癌，術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。以癌旁正常腎組織作為對照組。所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。

1.2.2 試劑 hMOF蛋白一抗為Bethyl公司生產(chǎn)的hMOF蛋白抗體(編號：IHC-00497)，抗體工作比例均為1∶250。

1.2.3 方法 采用免疫組化染色，將常規(guī)石蠟包埋的蠟塊，每例做2 μm連續(xù)切片2張，分別行HE染色與免疫組織化學法(LSAB方法)染色。將切片置于有保護膜的載玻片上，常規(guī)脫蠟，逐級水化，用0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30 min，微波爐沸騰10 min，再將切片行常規(guī)LSAB法染色。用已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結(jié)果判定 采用雙盲法，由2位有豐富臨床經(jīng)驗的病理醫(yī)師進行。hMOF以細胞核著色、呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性；根據(jù)染色強度與陽性細胞比率雙評半定量法進行評分，A:陽性細胞百分率<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；B：根據(jù)切片染色程度進行評分，未染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。最后根據(jù)陽性細胞率的得分與染色程度得分相乘作為結(jié)果進行判定，0分定為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強陽性()。本實驗中采用免疫組織化學染色評分≤4分和>4分2組進行比較。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料和率的比較采用四格表精確概率法和χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測結(jié)果

9例RCC組織中，4例(44.4%)hMOF mRNA表達水平較其癌旁正常腎組織下降2倍以上(即log2<-1)，其中FuhrmanⅡ級1例，F(xiàn)uhrmanⅢ級3例。RCC組織中hMOF的表達量明顯低于正常腎組織。見圖1。

2.2 免疫組織化學染色結(jié)果

RCC組織中hMOF表達量明顯低于正常腎組織，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。FuhrmanⅢ級中hMOF表達明顯低于FuhrmanⅠ～Ⅱ級，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。中低分化RCC組織hMOF表達明顯低于高分化組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2(插頁四)。

圖1 qRT-PCR分析結(jié)果

2.3 hMOF蛋白表達水平與RCC患者臨床特征的關(guān)系

根據(jù)RCC組織中hMOF蛋白表達水平的綜合免疫組織化學評分，將患者分為hMOF綜合免疫組織化學評分≤4分和>4分2組。比較2組間臨床資料的特點，不同年齡及性別的患者腎癌組織中hMOF蛋白表達量相差不大，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。hMOF蛋白隨腎癌組織Fuhrman 分級及病理分期的增高表達量下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，hMOF蛋白表達水平降低的腎癌患者其區(qū)域淋巴結(jié)及遠處器官轉(zhuǎn)移的風險增高。見表1。

表1 hMOF蛋白表達與腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

基因有序的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是機體細胞維持正常功能的前提，如果基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能紊亂，細胞可能發(fā)生癌變。遺傳調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控共同控制真核基因的表達。隨著人們對疾病認識的進一步加深，表觀遺傳疾病越來越受到重視。表觀遺傳是指基于非基因序列改變所致基因表達水平的變化，即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變[4]。表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化、RNA干涉、組蛋白修飾等方面，其中組蛋白修飾引起的染色體局部構(gòu)象的改變，在真核生物基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。組蛋白修飾主要包括對組蛋白尾部的賴氨酸和精氨酸殘基的乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。其中組蛋白的乙?；揎椵^為普遍。組蛋白乙酰化修飾直接影響核小體的結(jié)構(gòu)，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結(jié)合位點[5]。如果組蛋白乙?；揎棾霈F(xiàn)了問題，基因組的蛋白表達將發(fā)生問題，從而導致癌癥的發(fā)生。調(diào)控組蛋白乙酰化和去乙?；氖且粚δ芟嗷マ卓沟拿浮狧ATs和HDACs。HATs主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙酰基，而HDACs則相反。兩者之間的動態(tài)平衡調(diào)控基因表達的穩(wěn)定[6]。任何一方的功能失調(diào)，都將導致人類疾病甚至惡性腫瘤的發(fā)生。乙?；傅耐蛔兛梢鹫；虿荒鼙磉_使抑癌基因或調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白出現(xiàn)異常，導致癌癥發(fā)生。去乙?；竿蛔兓蛞恍┖腿ヒ阴；赶嚓P(guān)蛋白的突變使去乙?；稿e誤募集而引發(fā)腫瘤等疾病[7]。

HATs可歸于兩大類：一類是GNAT家族，另一類是MYST家族。hMOF是MYST HATs家族的成員,又稱MYST1。MYST HATs家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一個在細胞核內(nèi)廣泛存在、并有著重要生物學功能的HATs 家族[8]。MYST家族對于維持細胞的正常生理活動具有十分重要的作用。hMOF蛋白最基本的功能是乙?；M蛋白H4第16位賴氨酸，進而產(chǎn)生一系列的生物學作用。60%的組蛋白H4呈單乙?；癄顟B(tài)，并且多數(shù)發(fā)生在組蛋白N端第16位賴氨酸(K16)[9]，即H4K16Ac。體外和體內(nèi)實驗[10]表明：hMOF介導的組蛋白H4K16乙酰化活性是染色體模板正確轉(zhuǎn)錄所必需的。大量的研究結(jié)果表明：惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與癌基因、抑癌基因異常密切相關(guān)，組蛋白乙?；揎椫苯佑绊懓┗虻募せ詈?或)抑癌基因的失活。所以組蛋白乙?；揎椀难芯坑兄谶M一步明確惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制。目前的研究[11]結(jié)果顯示：hMOF蛋白表達異?？赡軐е氯橄侔⒊缮窠?jīng)管細胞瘤等惡性腫瘤的發(fā)生，并提示其有可能成為腫瘤術(shù)后輔助治療的關(guān)鍵生物學指標。本研究結(jié)果顯示：hMOF蛋白的mRNA表達量在癌組織中明顯降低，與Pfister等[11]研究的原發(fā)性乳腺癌和成神經(jīng)管細胞瘤的結(jié)果具有相同的趨勢，提示hMOF蛋白在腎癌組織表達降低發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。目前尚無關(guān)于hMOF蛋白轉(zhuǎn)錄水平降低原因的報道，有待于進一步研究，可以從DNA轉(zhuǎn)錄的起始部位即啟動子的角度進行研究來揭示導致hMOF蛋白表達量降低的原因及其與癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

本研究中hMOF蛋白在腎癌組織中表達免疫組織化學評分≤4分為62.1%(39/66),而hMOF蛋白在癌旁組織中表達免疫組織化學評分≤4分僅為6.1%(4/66)，提示hMOF表達的降低是引起RCC發(fā)生的一個重要因素；另外中低分化RCC組織中hMOF表達量明顯低于高分化組，提示hMOF表達的高低與腫瘤惡性程度呈負相關(guān)，即腫瘤的惡性程度越高，hMOF的表達量越低。揭示hMOF表達量的降低可促使腫瘤的進一步發(fā)展。此外，由于RCC根治術(shù)后局部復發(fā)率僅為1%～2%[12]，本研究66例RCC患者僅有6例出現(xiàn)了腎門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處器官的轉(zhuǎn)移，鑒于病例數(shù)量較少，隨訪時間較短，目前尚無法通過多變量回歸分析來確定hMOF蛋白作為分子標志物判斷腎癌患者預后的有效性。隨著病例數(shù)量的增加、隨訪時間的延長，這一問題將會得到進一步明確。

綜上所述，hMOF蛋白表達異常與腎癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可能作為判定腎癌惡性程度的一項客觀指標，對腎癌的診斷及預后判斷具有重要意義。

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