崔殿龍，解百宜，胡 蒙，向 欣，包傳恩，陳玉強

(1.廈門大學附屬成功醫(yī)院 解放軍第一七四醫(yī)院腫瘤外科，福建 廈門 361003；

2.廈門大學附屬成功醫(yī)院 解放軍第一七四醫(yī)院腫瘤內科，福建 廈門 361003)

目前已經證實甲狀腺激素(T3及T4)對乳腺、神經膠質以及甲狀腺腫瘤細胞增殖可發(fā)揮促進作用。另外，通過對一種突變型甲狀腺激素核受體的轉基因鼠研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素核受體能加速浸潤性甲狀腺癌的發(fā)生，與腫瘤細胞生長相關[1]。近期臨床證據表明：甲狀腺功能減退可以影響多形性成膠質細胞瘤和乳腺癌的生長[2]。有研究[3-4]證實: 一種脫氨基形式的甲狀腺激素—四碘甲腺乙酸(tetraiodothyroacetic acid，Tetrac)可拮抗多種激素的促增殖效應，并通過抑制細胞增殖和血管形成發(fā)揮抗腫瘤功能。目前已發(fā)現(xiàn)腫瘤的多種藥物抵抗機制，包括表達藥物抵抗泵基因[5]，其產物能插入細胞膜，將化療藥物運出到細胞外基質，而甲狀腺激素可以作用于Na+/H+逆向轉運[6]等質膜運輸系統(tǒng)。本文作者研究使用Tetrac抑制阿霉素(doxorubicin,Dox)抵抗性人胃癌細胞系SGC-7901/R體內外增殖的可能性及可能機制，旨在為耐藥性胃癌治療提供實驗依據。目前國內外尚無相關文獻報道。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑人胃癌細胞系SGC-7901為本實驗室保存。DMEM和胎牛血清購自美國Invitrogen公司。Dox和Tetrac購自美國Sigma公司，14C標記的Dox和增強化學發(fā)光試劑(ECL)購自美國Amersham公司，藥物轉運子P糖蛋白(drug transporter P-glycoprotein，P-gp)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferase，GST)抗體以及β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國BioRad公司。通過腫瘤細胞與Dox孵育，逐漸增加藥物濃度(從10-9mol·L-1到10-5mol·L-1)，培養(yǎng)6個月以上即構建成功藥物抵抗細胞系(SGC-7901/R)。

1.2 體外實驗體外實驗分為SGC-7901與SGC-7901/R 2組，分別與不同濃度Tetrac(25～125 mg·L-1)以及經典抗腫瘤藥物依托泊苷(Etop，10-4mol·L-1)、Dox(10-7mol·L-1)、順鉑(Cisp，10-6mol·L-1)共同培養(yǎng)4 d，或首先使用Tetrac(30 mg·L-1)預處理，然后分別用上述經典抗腫瘤藥物孵育4 d。MTT法檢測其細胞活性，最終結果以不同藥物濃度下的腫瘤細胞存活率來表示。

1.3 Western blotting檢測培養(yǎng)單層細胞至90%融合，用PBS沖洗后，使用50 mmol·L-1HEPES(pH 7.4)、150 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1NaF、1 mmol·L-1MgCl2、1.5 mmol·L-1EGTA、10%甘油、1%TritonX-100、1 mg·L-1亮抑酶肽和1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟裂解細胞。通過12% SDS-PAGE電泳分離等量蛋白，并將其轉移至醋酸纖維素膜上。使用特異性一抗和二抗標記特異性蛋白并通過辣根過氧化物酶及ECL感光膠片顯色。分析Tetrac、Dox單獨或聯(lián)合應用對SGC-7901/R中相關耐藥基因P-gp、SOD和GST表達的影響。

1.4 Dox聚集度檢測Dox抵抗細胞接種在12孔板中，孵育24 h后加入14C標記的Dox(185 Bq)，加或不加入Tetrac(30 mg·L-1)繼續(xù)孵育24 h。用冰冷PBS清洗細胞3次并裂解。用液閃儀檢測裂解產物中Dox聚集度。細胞比例高。

1.5 衰老相關的β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-b-Gal)染色細胞種植在24孔板中，用DMEM培養(yǎng)24 h，Dox、Tetrac單獨或聯(lián)合加入并培養(yǎng)5 d。常規(guī)β-半乳糖苷酶染色[5]。主要步驟包括：①用3%甲醛孵育5 min 固定細胞；②沖洗后在37°C與X-gal(1 g·L-1)孵育，使用含40 mmol·L-1檸檬酸(pH 6.5)、5 mmol·L-1氰亞鐵酸鉀、5 mmol·L-1鐵氰化鉀、150 mmol·L-1NaCl和2 mmol·L-1MgCl2的溶液溶解；③24 h后在相差顯微鏡下照相。最終結果以染色陽性細胞百分比來表示，陽性細胞比例高說明衰老細胞比例高。

1.6 凋亡相關的煙酸已可堿(Hoechst)染色細胞接種在100 mm培養(yǎng)皿中，Dox、Tetrac單獨或聯(lián)合加入并培養(yǎng)24 h。使用胰酶在37°C消化3 min。離心獲得細胞后用4%甲醛固定。PBS沖洗后用0.1 mg·L-1Hoechst 33248孵育，在玻片上顯色并用顯微鏡觀察，計數(shù)陽性細胞。陽性細胞比例高說明凋亡細胞比例高。

1.7 實驗動物Balb/c系裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司(5～6周齡，體質量30 g左右)。腋部皮下注射SGC-7901/R細胞(106·100 μL-1)，腫瘤生長至50 mm3左右時動物被分成4組(n=7)：①生理鹽水對照組；②Tetrac治療組(30 mg·kg-1)；③Dox治療組(2 mg·kg-1)；④Tetrac(30 mg·kg-1)+Dox(2 mg·kg-1)聯(lián)合藥物治療組。每組小鼠均在第10、13及16天連續(xù)3 d每日1次、共進行3次腹腔注射。觀測小鼠體質量,檢測藥物毒性和致死劑量。每周使用游標卡尺測量腫瘤直徑3次，連續(xù)測量3周以上。使用公式V=寬度×長度2/2計算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。

2 結 果

2.1 Tetrac對SGC-7901和SGC-7901/R細胞系增殖的抑制作用Dox組SGC-7901細胞活性隨Dox濃度逐漸增大而明顯減弱，SGC-7901/R細胞只在極高濃度情況下(>10-6mol·L-1)才開始發(fā)生壞死(圖1A)。在Tetrac干預組，無論是Dox敏感還是抵抗細胞系均隨Tetrac濃度升高而壞死明顯加快，在100 mg·L-1時細胞全部死亡(圖1B)。

2.2 Tetrac對經典抗腫瘤藥物的增強作用Dox、Etop及Cisp 3種藥物分別聯(lián)合Tetrac作用于SGC-7901/R細胞系，其抑制作用比單獨應用時明顯增強(P<0.001)。見表1。

圖1 Tetrac對Dox敏感性和抵抗性腫瘤細胞增殖的作用

表1 Tetrac對藥物抵抗的逆轉作用

2.3 Tetrac作用下腫瘤細胞對藥物的敏感性與SGC-7901細胞比較，P-gp轉運子在Dox抵抗的SGC-7901/R細胞中過表達，而其他藥物抵抗分子(如SOD和GST)的表達在2個細胞系間并無明顯差別(圖2A);Western blotting結果表明：Tetrac和Dox單獨或聯(lián)用均未影響SGC-7901/R中多種藥物抵抗基因P-gp、SOD和GST的表達(圖2B)。放射性標記的Dox檢測結果顯示：與單獨應用Dox組 [(623.70±116.45)DPM/106細胞]比較，Tetrac處理后細胞內Dox的濃度[(1 486.50±39.33)DPM/106細胞]明顯增高(P<0.001)，表明P-gp的功能可被Tetrac所抑制。

2.4 Tetrac對藥物抵抗細胞發(fā)生衰老和凋亡的促進作用2個單獨用藥組衰老細胞均很少，而聯(lián)合用藥組處于衰老狀態(tài)的細胞百分比明顯升高(P<0.001)，表明聯(lián)合用藥組的大部分細胞處于凋亡狀態(tài)。見表2。

2.5 Tetrac對藥物抵抗性腫瘤體內增殖能力抑制作用Dox的最大耐受劑量是2.5 mg·kg-1，而Tetrac即使應用超過60 mg·kg-1也未產生毒副作用。Dox組腫瘤生長無改變，而Tetrac組腫瘤體積減少70%。聯(lián)合用藥效果并未進一步增加，說明在使用濃度上二者不具備明顯的協(xié)同作用。見圖3。

圖2 Tetrac對經典藥物抵抗基因和藥物轉運子表達的影響

表2 Tetrac對藥物抵抗細胞發(fā)生衰老和凋亡的促進作用

圖3 Tetrac對裸鼠中Dox抵抗性腫瘤增殖的影響

3 討 論

腫瘤細胞的明顯特點是有一定適應能力，能對任何類型的壓力產生抗性。從臨床觀點來看，這可能是治療失敗或腫瘤再發(fā)的重要原因。因此，研發(fā)預防腫瘤產生耐藥性的方法具有很重要的臨床意義。近年來，抗腫瘤藥的品種增加很快，主要集中在抑制多種離子通道方面。這些藥物在體外多有逆轉腫瘤藥物抵抗的作用，但在體內卻經常失去作用，有的還具有高毒性。在研究新型、低毒的藥物抵抗調節(jié)劑時，人們發(fā)現(xiàn)了甲狀腺激素拮抗劑Tetrac[7]。與其他物抵抗逆轉性藥物不同，Tetrac無明顯毒副作用，可同時作用于藥物轉運子和控制藥物敏感性的信號途徑，導致細胞衰老甚至凋亡;這些特點使Tetrac成為一種新型的抗腫瘤藥物[8-10]。

本文作者最初發(fā)現(xiàn):Tetrac在體外抑制藥物敏感性和抵抗性細胞的效果相當，表明這種拮抗劑具有克服藥物抵抗的作用。SGC-7901/R細胞對于Dox、Etop和Cisp的敏感性在加入Tetrac后明顯增強。由于SGC-7901/R細胞對不同藥物抵抗的機制不同，Tetrac可能對多種藥物抵抗途徑均有調節(jié)作用。本研究結果顯示：Tetrac對細胞內P-gp、SOD和GST表達無明顯影響，但在加用Tetrac后細胞內聚集的放射性Dox明顯增加，說明Tetrac可抑制P-gp的活性功能。而藥物轉運子P-gp的過表達是抵抗拓撲異構酶抑制劑(如Dox和Etop)的標志，間接證明了體內激素平衡調節(jié)腫瘤對化療藥物反應性的重要作用，同時反映了Tetrac在抑制藥物抵抗性腫瘤細胞方面的潛力。本研究結果顯示：Tetrac可增強SGC-7901/R細胞對Dox、Cisp和Etop的敏感性，但細胞數(shù)量減少的機制仍然不明。Tetrac和Dox聯(lián)合處理的SGC-7901/R細胞中，β-半乳糖苷酶和煙酸已可堿陽性細胞明顯增加，表明Tetrac可通過強迫腫瘤發(fā)生衰老或凋亡來逆轉腫瘤的耐藥性。但對于大多數(shù)實體性腫瘤，對化療藥物敏感導致的細胞不一定均會凋亡。最近研究發(fā)現(xiàn)：誘導細胞發(fā)生衰老的能力強弱與腫瘤細胞的結局相關，所以很可能Tetrac不僅對實體性腫瘤敏感，還可能對浸潤性腫瘤和造血系統(tǒng)腫瘤也比較敏感。結合本研究在體內抑瘤實驗中獲得的明顯效果，且未發(fā)現(xiàn)Tetrac明顯的毒副作用，說明單獨應用Tetrac也具有很強的抑瘤效果。單純聯(lián)用一、兩個劑量很難決定是否Tetrac與Dox具有協(xié)同作用，進一步優(yōu)化實驗條件將有助于明確Tetrac與Dox發(fā)揮協(xié)同抑瘤效果體內所需的給藥劑量。

綜上所述，本研究結果證明：Tetrac具有體內和體外抗腫瘤活性。這種甲狀腺激素的類似物可抑制傳統(tǒng)方法抵抗性腫瘤細胞系的增殖。該藥物除了能夠抑制腫瘤血管生成之外，且無毒性，有望成為治療多種腫瘤的新藥。

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