王博蔚，高 尚，朱振威，劉春麗,朱 鎮(zhèn)，劉志輝

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021；

3.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；4.江蘇省鎮(zhèn)江市口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是能誘導(dǎo)血管生成、增加血管通透性及維持血管功能的強(qiáng)效促血管形成因子，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-3]，將其運(yùn)用于難愈性創(chuàng)傷的治療是目前研究的焦點(diǎn)，VEGF家族有5種亞型，其中VEGF165是最為重要的表型。因?yàn)閂EGF半衰期較短，在正常組織中約為30～45 min，在缺血部位能延長(zhǎng)至6～8 h，這就要求有一個(gè)緩釋系統(tǒng)以延長(zhǎng)VEGF作用于創(chuàng)傷修復(fù)部位的時(shí)間。近年研究者[4-10]發(fā)現(xiàn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)及脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用潛能，可以向創(chuàng)傷局部擴(kuò)充歸巢，向創(chuàng)傷修復(fù)細(xì)胞—內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞定向分化或通過(guò)創(chuàng)造增強(qiáng)修復(fù)的微環(huán)境促進(jìn)組織內(nèi)源性細(xì)胞的再生，從而加速創(chuàng)傷愈合；干細(xì)胞同時(shí)也是基因治療的良好載體細(xì)胞，可以攜帶目的基因到達(dá)靶區(qū)域發(fā)揮治療作用。人胎盤(pán)源間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta -derived mesenchymal stem cells，HPMSCs)是近幾年逐漸受到關(guān)注的新的成體干細(xì)胞來(lái)源，本文作者前期研究[11-12]表明：HPMSCs在形態(tài)及生物學(xué)性狀方面與BMSCs基本一致，在特定誘導(dǎo)條件下可以向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化，提示HPMSCs可以作為創(chuàng)傷修復(fù)的種子細(xì)胞。本研究擬構(gòu)建VEGF的真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hVEGF165，并通過(guò)脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入HPMSCs中，探討hVEGF165對(duì)HPMSCs增殖的影響及攜帶目的基因的HPMSCs的多向分化潛能，旨在為進(jìn)一步應(yīng)用VEGF轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞移植方法治療難愈性創(chuàng)傷的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人白血病細(xì)胞 HL-60(吉林大學(xué)第二醫(yī)院沈維章博士惠贈(zèng))，大腸桿菌 DH5α(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)。HPMSCs已經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并鑒定,來(lái)源于吉林大學(xué)第二醫(yī)院產(chǎn)科廢棄的胎盤(pán)，經(jīng)產(chǎn)婦同意，通過(guò)密度梯度離心法分離培養(yǎng)獲得。HPMSCs屬于成體干細(xì)胞，不涉及倫理問(wèn)題，引物(Cyagen Biosciences),RT-PCR試劑盒、 瓊脂糖,T4噬菌體DNA連接酶、DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒(Promega)，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ(Takara)，LB(明海生物制品公司),DNA-Marker、Trizol、 溴化乙錠(EB) 、DEPC和IMDM 培養(yǎng)液(Sigma,USA)，小牛血清(Hyclone)，PBS(北京中山生物技術(shù)有限公司)，pMD18 T vector和真核表達(dá)質(zhì)粒 pIRES2-EGFP (Clontech,USA)，Lipofectin脂質(zhì)體懸液(Gibco)，DEME培養(yǎng)基、ECV304(基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室惠贈(zèng))，G418選擇培養(yǎng)基(寶泰克公司)。

1.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165的構(gòu)建及鑒定

1.2.1 目的基因片段VEGF165的獲得與擴(kuò)增 HL-60 細(xì)胞用含10%小牛血清的 IMDM 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)瓶底 80%時(shí)，收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)，用 Trizol 提取 HL-60 細(xì)胞的總 RNA，測(cè)定RNA的濃度，A260/A280比值在 1.8 時(shí)最佳。cDNA 第1 鏈采用Oligo ( dT) 和M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，按操作說(shuō)明合成。PCR 引物設(shè)計(jì)與合成：從 GenBank 中查找 hVEGF165 的全長(zhǎng)基因序列，按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，設(shè)計(jì)1對(duì)上游由啟始密碼子ATG 開(kāi)始，下游以終止密碼子TGA 結(jié)尾的引物，并分別在上、下游引物上添加EcoRⅠ與BamHⅠ 限制性酶切位點(diǎn)序列，送Cyagen Biosciences合成hVEGF165引物序列：上游，5′-CGGAATTCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG-TG-3′，含EcoRⅠ 限制性酶切位點(diǎn)；下游,5′-CGGGATCCTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCT-3′，含BamHⅠ 限制性酶切位點(diǎn)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶切膠回收和純化。將純化后的hVEGF165 PCR產(chǎn)物連接至克隆載體 pMD18 -T vector。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中。觀察菌落生長(zhǎng)情況，藍(lán)、白斑篩選陽(yáng)性細(xì)菌克隆，培養(yǎng)后進(jìn)行 PCR 篩選,最后進(jìn)行重組克隆載體 pMD18-T vector-hVEGF165 的酶切鑒定。

1.2.2 pIRES2-EGFP-hVEGF165 的構(gòu)建及鑒定 用EcoRⅠ 、BamHⅠ 雙酶切 pMD18-T-hVEGF165與pIRES2-EGFP，用T4DNA連接酶將上述回收產(chǎn)物進(jìn)行粘端連接，構(gòu)建 pIRES2-EGFP-hVEGF165，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α,pIRES2-EGFP-hVEGF165 的雙酶切鑒定。

1.3 pIRES2-EGFP-hVEGF165轉(zhuǎn)染HPMSCs

1 mL無(wú)血清完全DEME稀釋pIRES2-EGFP-hVEGF165和pIRES2-EGFP，渦旋1 s,加Lipofectin脂質(zhì)體懸液，再渦旋，室溫放置5～10 min，使二者結(jié)合，制備pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin復(fù)合物和pIRES2-EGFP-Lipofectin復(fù)合物。A組在每個(gè)培養(yǎng)孔的培養(yǎng)細(xì)胞中加入pIRES2-EGFP-hVEGF165-Lipofectin復(fù)合物;B組在每個(gè)培養(yǎng)孔的培養(yǎng)細(xì)胞中加入pIRES2-EGFP -Lipofectin復(fù)合物;C組為對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組，有pIRES2-EGFP-Lipofectin 無(wú) HPMSCs)。將細(xì)胞培養(yǎng)于最小致死劑量0.5 g·L-1的G418選擇培養(yǎng)基中，抗性細(xì)胞篩選，15 d篩選出陽(yáng)性細(xì)胞克隆，其陽(yáng)性克隆在0.5 g·L-1的G418維持劑量下繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)2周備用。

1.4 HPMSCs轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP- hVEGF165后VEGF表達(dá)活性鑒定

①轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表達(dá)VEGF蛋白的Western blotting檢測(cè);②MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs所表達(dá)的VEGF的生物學(xué)活性:將人內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304用2×103孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中，并加入1/2體積的各組轉(zhuǎn)染上清液,加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO液100 μL,震動(dòng)搖晃，待藍(lán)色沉淀充分溶解后，測(cè)定各孔A480值。③MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs增殖活性的變化：分別取生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞接種于96孔板，每孔加各組細(xì)胞懸液200 μL，培養(yǎng)36 h后，每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO。選擇490 nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔的A值。④熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果：通過(guò)報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)觀察目的基因轉(zhuǎn)染情況。

1.5 鑒定轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs的多向分化潛能

①成脂肪誘導(dǎo)。誘導(dǎo)體系：含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松1 μmol·L-1、消炎痛200 μmol·L-1、IBMX 0.5 mmol·L-1、胰島素10 mg·L-1，油紅染色鑒定脂滴形成。②成軟骨誘導(dǎo)。誘導(dǎo)體系：含2.5%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG并加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉6.25 mg·L-1、BSA 1.25 mg·L-1、丙酮酸鈉1 mmol·L-1，抗壞血酸磷酸37.5 mg·L-1，TGF-β150 μg·L-1，Alcian blue染色鑒定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 pIRES2-EGFP-hVEGF165的構(gòu)建及鑒定

2.1.1目的基因片段的擴(kuò)增 VEGF165 基因序列全長(zhǎng)為 576 bp,取逆轉(zhuǎn)錄 PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在大約 600 bp 處出現(xiàn)有目的條帶，見(jiàn)圖1。

2.1.2 重組克隆載體 pMD18-T-hVEGF165 的雙酶切鑒定 限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組克隆載體電泳結(jié)果顯示：在約600 bp 處出現(xiàn)一條帶，與目的片段大小一致。見(jiàn)圖2。

2.1.3 重組表達(dá)載體的酶切鑒定 pIRES2-EGFP-hVEGF165重組表達(dá)載體經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后電泳結(jié)果顯示：重組體中含有與目的片段大小一致的片段。見(jiàn)圖3。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 pMD18-T-hVEGF165重組質(zhì)粒EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后電泳圖

圖3 EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pIRES2-EGFP-hVEGF165的電泳結(jié)果

2.2 pIRES2-EGFP- hVEGF165轉(zhuǎn)染HPMSCs

2.2.1 G418篩選結(jié)果 C組在第5天時(shí)細(xì)胞已經(jīng)全部死亡；而A組與B組在篩選的第7天有少數(shù)細(xì)胞存活，每低倍視野約為1～5個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)基篩選，15 d后出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆。見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs

2.2.2 RT-PCR檢測(cè)hVEGF165的表達(dá) 在凝膠圖像分析系統(tǒng)上可見(jiàn)A組HPMSCs 中hVEGF165的表達(dá)較B組強(qiáng)。B組也有與目的片段大小一致的片段表達(dá)。見(jiàn)圖5。

2.2.3 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs表達(dá)hVEGF165的Westren blotting分析 B組在45 000 bp 處見(jiàn)一表達(dá)較弱反應(yīng)顯色帶，而A組在45 000 bp處顯現(xiàn)單一特異性較強(qiáng)反應(yīng)顯色帶，為hVEGF165基因表達(dá)產(chǎn)物。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs 中hVEGF165的表達(dá)

2.2.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP- hVEGF165的HPMSCs中VEGF165的生物學(xué)活性 A組HPMSCs表達(dá)的VEGF165的生物學(xué)活性(0.870 0±0.028 5)明顯高于B組(0.690 0±0.087 6)和C組(0.540 0±0.012 4) (P<0.01)，B組高于C組(P<0.05)，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.5 轉(zhuǎn)染hVEGF165的HPMSCs細(xì)胞增殖活性的變化 A組HPMSCs增殖活性(0.624±0.019)明顯高于B組(0.426±0.016)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 熒光顯微鏡下重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后，A和B組中均可見(jiàn)大量表達(dá)EGFP的細(xì)胞;轉(zhuǎn)染48～72 h后，為綠色熒光表達(dá)高峰期;1周后表達(dá)開(kāi)始減弱，至3周時(shí)仍可見(jiàn)EGFP的表達(dá)。見(jiàn)圖7(插頁(yè)三)。

2.4 轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs多向分化潛能的鑒定

在成脂肪誘導(dǎo)環(huán)境下誘導(dǎo)2周后，用油紅O染色，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色(圖8A，見(jiàn)插頁(yè)三)；在成軟骨誘導(dǎo)環(huán)境下誘導(dǎo)2周后，將細(xì)胞團(tuán)打散涂片，Alcian blue染色，高倍鏡下可見(jiàn)Ⅱ型膠原形成的細(xì)胞外基質(zhì)被特異性染成藍(lán)色(圖8B，見(jiàn)插頁(yè)三)。

3 討 論

目前基因治療已成為世界上最活躍的研究領(lǐng)域，幾乎滲透到醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。VEGF在促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)與組織愈合過(guò)程中發(fā)揮的重要作用已經(jīng)得到學(xué)者的普遍認(rèn)同，但是由于VEGF單獨(dú)應(yīng)用存在半衰期短、穿透力差、易于吸附細(xì)胞外基質(zhì)、生物利用率低、需反復(fù)使用且劑量較大、費(fèi)用昂貴等不利因素，使其臨床應(yīng)用受到限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使創(chuàng)面局部組織VEGF165高效、長(zhǎng)效表達(dá)，可克服直接應(yīng)用外源性VEGF165的缺點(diǎn)，并利用干細(xì)胞作為目的基因的載體，一方面發(fā)揮其本身促進(jìn)創(chuàng)傷的作用，另一方面運(yùn)送目的基因到達(dá)靶區(qū)域發(fā)揮促愈作用，有望為難愈性創(chuàng)傷的治療開(kāi)辟新的途徑。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-hVEGF165。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染法是目前最常用的方法之一,技術(shù)成熟,安全可靠；其中以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的載體系統(tǒng)(質(zhì)粒) 的應(yīng)用最為廣泛,其無(wú)免疫原性、無(wú)毒、無(wú)致癌性,易大量制備,轉(zhuǎn)染效率雖不及病毒載體高,但已通過(guò)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH) 和重組DNA 咨詢(xún)委員會(huì)(RAC) 的批準(zhǔn)作為基因治療的載體進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn),用于某些癌癥的治療。因此,從后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全等方面的綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選擇陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的pIRES2- EGFP-hVEGF165轉(zhuǎn)染HPMSCs,使VEGF在細(xì)胞內(nèi)高效、穩(wěn)定地暫時(shí)表達(dá)。這既符合創(chuàng)傷修復(fù)基因治療的要求,同時(shí)又避免病毒載體介導(dǎo)的基因治療有可能存在的潛在缺陷性。轉(zhuǎn)染48 h后，通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到A組及B組中有大量EGFP表達(dá)，提示報(bào)告基因已成功轉(zhuǎn)入HPMSCs，說(shuō)明脂質(zhì)體介導(dǎo)的pIRES2-EGFP-hVEGF165轉(zhuǎn)染HPMSCs是可行的。RT-PCR及Western blotting檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)pIRES2-EGFP-hVEGF165轉(zhuǎn)染的HPMSCs有VEGF強(qiáng)表達(dá)，pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染的HPMSCs也有VEGF的表達(dá)，但表達(dá)較弱；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面說(shuō)明VEGF已成功轉(zhuǎn)入HPMSCs中，另一方面說(shuō)明HPMSCs本身具有VEGF的內(nèi)分泌功能。

本研究中MTT法結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165的HPMSCs所表達(dá)的hVEGF165的生物學(xué)活性明顯提高，提示hVEGF165轉(zhuǎn)染HPMSCs后得到持續(xù)高效表達(dá)。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP的HPMSCs所表達(dá)的hVEGF165的生物學(xué)活性高于空白對(duì)照組，提示HPMSCs本身具有hVEGF165的內(nèi)分泌功能。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-hVEGF165后HPMSCs的增殖活性明顯增強(qiáng)，說(shuō)明hVEGF165對(duì)HPMSCs的增殖起促進(jìn)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pIRES2-EGFP- hVEGF165真核表達(dá)載體，并運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其成功轉(zhuǎn)入HPMSCs中，一方面hVEGF165在HPMSCs中有較強(qiáng)表達(dá)并被正確修飾，說(shuō)明HPMSCs可以作為hVEGF165基因治療的載體細(xì)胞,轉(zhuǎn)VEGF基因HPMSCs可以實(shí)現(xiàn)hVEGF165的緩釋長(zhǎng)效作用；另一方面提示HPMSCs本身也具有內(nèi)分泌hVEGF165的功能，但作用較弱，hVEGF165對(duì)HPMSCs的增殖具有明顯促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)為下一步運(yùn)用攜帶hVEGF165基因的HPMSCs治療難愈性創(chuàng)傷的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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