韋安慧，李會(huì)敏，付常皓，王浩天，王文加，蘇曼曼，顏煒群

(1.吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021； 2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。近年來，隨著胰島素治療的改善，胰腺和胰島細(xì)胞移植成為治療糖尿病的有效途徑[1-2]。但是胰腺和胰島細(xì)胞移植治療受到供體來源不足和移植排斥等因素的限制[3]。干細(xì)胞研究為胰島細(xì)胞來源開辟了新的途徑。通過干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化，可以產(chǎn)生大量有功能的胰島樣細(xì)胞，進(jìn)而移植治療糖尿病[4-6]。胚胎干細(xì)胞具有分化的全能型，體外可以分化為胰島素分泌細(xì)胞[7-8]，但是存在潛在致瘤性和倫理道德的問題，因此成體干細(xì)胞成為了理想的細(xì)胞來源。Timper等[9-10]誘導(dǎo)人脂肪基質(zhì)細(xì)胞(human adipose tissue-derived stromal cells,hADSCs)分化為胰島素分泌細(xì)胞，但是誘導(dǎo)后細(xì)胞是否受葡萄糖調(diào)節(jié)未檢測(cè)，而且誘導(dǎo)后細(xì)胞的分化率低。在此基礎(chǔ)上，本研究利用exendin-4、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和尼克酰胺等誘導(dǎo)hADSCs形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)、分泌胰島素，旨在探討hADSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的潛能，為其應(yīng)用于臨床移植治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清、exendin-4(Sigma)、尼克酰胺、雙硫腙、bFGF(Promega)、Trizol試劑(Invitrogen)，引物由上海生工合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)脂肪組織由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院整形外科提供，供者均為健康女性，年齡20～35歲，吸脂部位為腰腹部。知情同意，將所得脂肪組織，低溫條件下2 h送到實(shí)驗(yàn)室操作。hADSCs參照文獻(xiàn)[11]的方法分離，分離后細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(含10%FBS和5 mg·L-1EGF)，接種于175 cm2的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、95%的空氣氣相下培養(yǎng)。每3 d換液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)傳代培養(yǎng)，傳代至3～5代時(shí)，進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

1.3 hADSCs向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代細(xì)胞，用細(xì)胞消化液消化，調(diào)整細(xì)胞密度至(0.5～1.0)×105mL-1，接種在膠原包被的6孔板中，置入37℃、5%的CO2、95%的空氣氣相下繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)至占培養(yǎng)皿底部80%時(shí)，基礎(chǔ)培養(yǎng)液(H-DMEM+10% FBS)更換為條件培養(yǎng)基(H-DMEM、2%FBS、10 nmol·L-1exendin-4和20 mg·L-1bFGF)，培養(yǎng)1周后，用L-DMEM+2% FBS+10 mg·L-1EGF+10 nmol·L-1exendin-4+10 mmol·L-1尼克酰胺誘導(dǎo)2周。

1.4 誘導(dǎo)后hADSCs的檢測(cè)①RT-PCR檢測(cè)：收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總的RNA，行RT-PCR。引物如下：胰島素，5′-agcctttgtgaaccaacacc-3′，5′-gctggtagagggagcagatg-3′；胰十二指腸同源性盒因子(pancreatic and duodenal homeobox 1,Pdx-1)，5′- gatgaagtctaccaaagctcacgc-3′，5′-ccagatcttgatgtgtctctcggtc-3′；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2 (glucose transporter 2,Glut-2)，5′-accctggttttcactgtcatcactg-3′，5′-gctttgattcttccaagtgtgtcc-3′；胰高血糖素(glucagon),5′-ctcagcttcccaggcagacccactc-3′，5′-agcatgtctgcggccaagttcttca-3′;GAPDH,5′-accacagtccatgccatcac-3′，5′-tccaccaccctgttgctgta-3′。引物由上海生工合成。②雙硫腙染色：50 mg雙硫腙粉末(dithzone)，加入5 mL DMSO中制成儲(chǔ)備液，充分溶解后過濾，上清作為工作液。使用時(shí)用0.1 mol·L-1PBS按1∶100比例稀釋。分別取誘導(dǎo)后胰島素分泌細(xì)胞和未誘導(dǎo)的hADSCs，PBS液漂洗2次，加入染色液，37℃溫育30 min，鏡下觀察，照相。③免疫熒光檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞：取誘導(dǎo)后細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定，PBS洗3次，0.25% TritonX-100處理10 min增加細(xì)胞膜的通透性，PBS洗3次，5%BSA濕盒封閉30 min，以防止非特異性吸附。加入一抗兔抗人胰島素，兔抗人Pdx-1，4℃過夜。第2天PBS洗3次，加入二抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃、30 min孵育，PBS洗3次，共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 葡萄糖刺激胰島素釋放實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞PBS洗滌3次后，分別加入低糖(含5.6 mmol·L-1葡萄糖)和高糖(含23.3 mmol·L-1葡萄糖)培養(yǎng)液刺激細(xì)胞，孵育1 h 后，收集細(xì)胞上清液，置于-20℃凍存。ELISA檢測(cè)上清中胰島素含量。

2 結(jié) 果

2.1 hADSCs的分離和培養(yǎng)細(xì)胞分離、接種24 h后，換液除去未貼壁的細(xì)胞。培養(yǎng)10 d后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)90%，可見細(xì)胞呈克隆狀生長(zhǎng)。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，1∶3傳代。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣。

2.2 體外hADSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞加入誘導(dǎo)液后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。誘導(dǎo)7 d左右細(xì)胞由長(zhǎng)梭形逐漸變成多邊形，并且開始聚集，培養(yǎng)15 d細(xì)胞呈島狀聚集，21 d左右形成胰島樣細(xì)胞團(tuán)(圖1，見插頁三)。對(duì)誘導(dǎo)后胰島樣細(xì)胞雙硫腙染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞團(tuán)呈紅色(圖2，見插頁三)，細(xì)胞團(tuán)周圍散在的單個(gè)細(xì)胞也呈陽性，對(duì)照組細(xì)胞則未著色，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)富含鋅離子，與胰島β細(xì)胞一致。

2.3 免疫熒光和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果免疫熒光染色顯示Pdx-1(圖3A，見插頁三)和胰島素(圖3B，見插頁三)在細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：胰島素基因、胰高血糖素、Pdx-1和Glut-2在細(xì)胞中表達(dá)。見圖4。

圖4 RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)

2.4 葡萄糖刺激胰島素分泌葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組上清中未檢測(cè)到胰島素，誘導(dǎo)后細(xì)胞低糖刺激胰島素分泌量為(60.21±9.14) μIU·L-1，高糖刺激胰島素分泌量為(146.27±11.13) μIU·L-1?？梢娬T導(dǎo)后細(xì)胞分泌胰島素，并且能感受培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的變化。

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSC分布廣泛，已從多種組織中分離出[12-13]。ADSCs包括不同成熟階段的脂肪前體細(xì)胞，其中分化程度低的基質(zhì)血管細(xì)胞(stromal-vascular cell，SV)證實(shí)為脂肪來源的MSC[14]。由于脂肪組織具有來源豐富、脂肪抽吸術(shù)簡(jiǎn)單易行、自體移植時(shí)無免疫排斥、易于分離培養(yǎng)、在體外具有很強(qiáng)的增殖能力和多分化潛能等優(yōu)點(diǎn)，已成為細(xì)胞治療和組織工程種子細(xì)胞的來源。干細(xì)胞在體外適宜的環(huán)境下可以分化為胰島素分泌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，在hADSCs分化的不同階段添加促分化或促成熟的因子，促進(jìn)其分化為胰島素分泌細(xì)胞。exendin-4具有明顯的促進(jìn)β細(xì)胞增殖和分化的作用。尼克酰胺和葡萄糖是誘導(dǎo)前體細(xì)胞向成熟胰島細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子。高糖有利于干細(xì)胞的分化。尼克酰胺是一種主要的內(nèi)分泌細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，促使胰島樣細(xì)胞團(tuán)的形成，增加胰島細(xì)胞的分化量，促進(jìn)細(xì)胞成熟。早期的高糖可以啟動(dòng)Pdx-1表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)的第2階段采用了低糖環(huán)境，因?yàn)槌掷m(xù)的高糖環(huán)境可以改變細(xì)胞β分化和胰島素分泌的模式，而使β細(xì)胞去分化。這些因子在不同階段適量加入，不僅有利于hADSCs的分化，而且有利于誘導(dǎo)后細(xì)胞的成熟和持續(xù)分泌胰島素。Pdx-1是胰腺發(fā)育及胰島素基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，決定了胰腺前體細(xì)胞向β細(xì)胞、α細(xì)胞和δ細(xì)胞分化[15]。Glut-2是存在于B細(xì)胞膜內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，并且直接關(guān)系到細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中RT-PCR顯示了基因Pdx-1、Glut-2、胰島素和胰高血糖素的表達(dá)；葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)顯示了誘導(dǎo)后細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激敏感，說明誘導(dǎo)后細(xì)胞具有與成熟胰島細(xì)胞相似的功能。

本實(shí)驗(yàn)成功誘導(dǎo)hADSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞，分化后細(xì)胞具有與胰島細(xì)胞相似的功能，為細(xì)胞移植治療糖尿病提供了細(xì)胞來源。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Shapiro AM,Lakey J,Ryan E,et al.Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen [J].N Engl J Med,2000,343(4):230-238.

[2]Shapiro AM,Ricordi C,Hering BJ,et al.International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation [J].N Engl J Med,2006,355(13):1318-1330.

[3]Berney T,Toso C.Monitoring of the islet graft [J].Diabetes Metab,2006,32(5 Pt 2):503-512.

[4]Kajiyama H,Hamazaki TS,Tokuhara M,et al.Pdx1-transfected adipose tissue-derived stem cells differentiate into insulin-producing cells in vivo and reduce hyperglycemia in diabetic mice [J].Int J Dev Biol,2010,54(4):699-705.

[5]D’Amour KA,Bang AG,Eliazer S,et al.Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells [J].Nat Biotechnol,2006,24(11):1392-1401.

[6]Sun Y,Chen L,Hou XG,et al.Differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from diabetic patients into insulin-producing cells in vitro [J].Clin Med J,2007,120(9):771-776.

[7]Segev H,Fishman B,Ziskind A,et al.Differentiation of human embryonic stem cells into insulin-producing clusters [J].Stem Cells,2004,22(3):265-274.

[8]Zhang D,Jiang W,Liu M,et al.Highly efficient differentiation of human ES cells and IPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells [J].Cell Res,2009,19(4): 429-438.

[9]Timper K,Seboek D,Eberhardt M,et al.Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin,somatostatin,and glucagon expressing cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,341(4):1135-1140.

[10]Lee J,Han DJ,Kim SC.In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,375(4):547-551.

[11]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells [J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[12]Erickson GR,Gimble JM,Franklin DM,et al.Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,290(2): 763-769.

[13]Ashjian PH,Elbarbary AS,Edmonds B,et al.In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors[J].Plast Reconstr Surg,2003,111(6): 1922-1931.

[14]Zuk PA,Zhu N,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-228.

[15]Yuan H,Li J,Xin N,et al.Expression of Pdx1 mediates differentiation from mesenchymal stem cells into insulin-producing cells[J].Mol Biol Rep,2010,37(8):4023-4031.