錢(qián) 明，劉 敏，段蒙娜，劉 暢，賀 璽，周延民

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

老齡化以及女性絕經(jīng)后發(fā)生的骨質(zhì)疏松加重現(xiàn)象多與全身激素水平改變相關(guān)。女性卵巢功能衰退引起雌激素下降，就會(huì)導(dǎo)致骨生成和骨吸收的平衡被打破，骨吸收大于新骨形成骨量，造成骨質(zhì)疏松。同樣，男性骨代謝也受到雌激素的調(diào)節(jié)?？s宮素(oxytocin,OT)是自垂體后葉分離出的一種9肽激素，其在體內(nèi)的主要作用包括在分娩過(guò)程中直接興奮子宮平滑肌，促進(jìn)其節(jié)律性收縮，具有催產(chǎn)、引產(chǎn)及減少產(chǎn)后出血等作用，故又被稱(chēng)為催產(chǎn)素，并且可刺激乳腺的平滑肌收縮，刺激泌乳。最近研究[1-3]發(fā)現(xiàn)：OT是對(duì)骨代謝有明確調(diào)節(jié)作用的多肽類(lèi)藥物之一。研究[3-6]表明：OT對(duì)骨形成的促進(jìn)作用主要是通過(guò)局部的直接作用實(shí)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞表面存在OT的功能性受體。目前國(guó)外僅有少量關(guān)于OT調(diào)節(jié)骨代謝方面的研究報(bào)道，且多以大鼠等動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[7-8]。OT在骨代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討OT在促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63增殖及成骨活性方面的作用，為其全身及局部應(yīng)用于調(diào)節(jié)骨代謝提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑人骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63)購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；OT購(gòu)自上海肽仕生物科技有限公司；四氮甲唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)，ALP試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、低糖DMEM及二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自杭州四季青公司。

1.2 主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANOY 美國(guó))，超凈工作臺(tái)(上海醫(yī)療器械廠)，倒置顯微鏡(OLYMPUS 日本)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國(guó))，臺(tái)式高速離心機(jī)(Hermlez323K，美國(guó))，電子天平(上海生物儀器廠)，無(wú)菌手術(shù)器械、細(xì)胞培養(yǎng)管及細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定MG-63細(xì)胞于含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)7 d，達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，呈長(zhǎng)梭型，長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%時(shí)，進(jìn)行傳代。倒掉舊培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶液0.5 mL，消化25 s，加入新培養(yǎng)基終止消化，用吸管將殘余貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)并使之均勻，1∶2進(jìn)行傳代。同上方法傳3代，至細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定備用。

1.4 MTT法檢測(cè)不同濃度OT作用后MG-63的增殖活性收集對(duì)數(shù)期MG-63細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至2.5×104mL-1。取96孔板鋪板，每孔200 μL,即每孔細(xì)胞數(shù)約為5 000個(gè)，37℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁，備用。將OT最終濃度設(shè)10、50和100 nmol·L-1共3個(gè)梯度，另設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥后各板于37℃、5% CO2全濕度下培養(yǎng)1、3、5和7 d。每孔加MTT液20 μL，繼續(xù)孵育4 h。去除培養(yǎng)液，每孔加150 μL的DMSO，搖床10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。

1.5 ELISA試劑盒檢測(cè)不同濃度OT作用后MG-63的成骨活性參考MTT檢測(cè)結(jié)果選取最低有效濃度50 nmol·L-1的OT作為實(shí)驗(yàn)濃度，分別檢測(cè)OT作用1、3、5和7 d后MG-63細(xì)胞ALP活性的變化。具體方法為：收集對(duì)數(shù)期MG-63細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106mL-1，反復(fù)凍融破壞細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)成分，2 500 r·min-1離心約15 min，收集上清。按照試劑盒操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行加樣、溫浴、洗滌、加酶等操作，加入終止液并于10 min內(nèi)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)下依序測(cè)量各孔的A值。每次測(cè)定的同時(shí)按要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 MG-63細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化傳代后4～6 h細(xì)胞貼壁，呈長(zhǎng)梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞折光性良好，邊界清晰，散在分布(圖1A，見(jiàn)插頁(yè)三)。5～7 d后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)對(duì)數(shù)期，分布呈魚(yú)群狀、漩渦狀，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，伸出偽足，胞漿內(nèi)可見(jiàn)不規(guī)則顆粒樣物質(zhì)，核仁清晰可見(jiàn)(圖1B，見(jiàn)插頁(yè)三)。

2.2 不同濃度OT作用下MG-63細(xì)胞增殖活性的變化MTT結(jié)果顯示：10 nmol·L-1組OT作用7 d 后MG-63細(xì)胞增殖活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)，50和100 nmol·L-1OT組在作用3、5和7 d 后MG-63細(xì)胞增殖活性明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。其他各組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 最低有效濃度OT作用下MG-63細(xì)胞ALP活性的變化50 nmol·L-1OT作用下，MG-63細(xì)胞ALP活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增強(qiáng)，對(duì)照組隨時(shí)間變化不明顯；50 nmol·L-1OT作用3、5和7 d后MG-63細(xì)胞ALP活性顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度OT作用不同時(shí)間后MG-63細(xì)胞增殖活性的變化

表2 50 nmol·L-1 OT作用不同時(shí)間后MG-63細(xì)胞ALP活性的變化

3 討 論

OT是一種產(chǎn)科常用藥物，藥物流產(chǎn)后常規(guī)注射OT可止血及幫助子宮收縮。但隨著OT在骨代謝領(lǐng)域相關(guān)作用的逐步闡明，更多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注其在骨代謝領(lǐng)域的作用。目前國(guó)外學(xué)者主要關(guān)注OT在全身應(yīng)用逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松方面的作用,局部應(yīng)用修復(fù)骨缺損方面研究尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示:10 nmol·L-1OT促進(jìn)MG-63 細(xì)胞增殖作用不明顯，而50 nmol·L-1以上濃度的OT能夠通過(guò)直接作用于人成骨細(xì)胞MG-63，顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇50 nmol·L-1作為OT作用于MG-63細(xì)胞的最低有效濃度進(jìn)行的ELISA檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該濃度作用下MG-63細(xì)胞的ALP活性有顯著提高。ALP是檢測(cè)成骨細(xì)胞成骨活性的最重要和最直接的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)證明一定濃度下的OT可以直接作用于MG-63 細(xì)胞，增加其成骨活性。這也是將OT應(yīng)用于局部治療骨損傷、促進(jìn)骨修復(fù)的前提。本實(shí)驗(yàn)僅證明了在一定濃度下OT對(duì)骨代謝有正向促進(jìn)作用，但具體的濃度作用范圍以及否存在劑量依賴(lài)性有待進(jìn)一步研究。而且本實(shí)驗(yàn)以人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，同實(shí)際在體內(nèi)作用與成骨細(xì)胞還存在較大的差距，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，OT的功能性受體存在于成骨細(xì)胞表面已經(jīng)被國(guó)外學(xué)者[9-11]所證明，但是OT促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，盡管OT對(duì)骨代謝系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明，但是本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度OT作用于MG-63細(xì)胞，對(duì)其增殖與成骨活性進(jìn)行體外研究，驗(yàn)證了OT作為促進(jìn)成骨藥物局部應(yīng)用于損傷部位的可行性，為臨床局部應(yīng)用OT修復(fù)骨損傷、促進(jìn)成骨提供了參考依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Tamma R,Colaianni G,Zhu LL,et al.Oxytocin is an anabolic bone hormone [J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(17):7149-7154.

[2]Copland JA,Ives KL,Simmons DJ,et al.Functional oxytocin receptors discovered in human osteoblasts[J].Endocrinology,1999,140(9):4371-4374.

[3]Silvia C,Graziana C,Giorgio M,et al.Human osteoclasts express oxytocin receptor[J].Biochem Biophys Res Commun,2002，297(3):442-445.

[4]Elabd C,Basillais A,Beaupied H,et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis [J].Stem Cells,2008,26(9):2399-2407.

[5]Woodrow JP,Sharpe CJ,Fudge NJ,et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis [J].Stem Cells,2008,26(9):2399-2407.

[6]Francisco J.New approaches to the treatment of osteoporosis [J].Endocr Pract,2010,29(1):1-23.

[7]Petersson M,Lagumdzija A,Stark A,et al.Oxytocin stimulates proliferation of human osteoblast-like cells [J].Peptides,2002,23(6):1121-1126.

[8]Elabd SK,Sabry I,Hassan WB,et al.Possible neuroendocrine role for oxytocin in bone remodeling [J].Endocr Regul,2007,41(4):131-141.

[9]Liu X,Shimono K,Zhu LL,et al.Oxytocin deficiency impairs maternal skeletal remodeling [J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(1):161- 166.

[10]Chen Y,Vasil,Rehaume,et al.Comparison of biophysical and biological properties of helical enantiomeric antimicrobial peptides [J].Chem Biol Drug,2006,67(1):162-173.

[11]McCormick RK.Osteoporosis:integrating biomarkers and other diagostic correlates into the management of bone fragility [J].Altern Med Rev,2007,12(1):113-145.