邊文超,戚良晨

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胸外科,吉林 長春 130033)

125I粒子是一種人工同位素，主要產(chǎn)生γ射線，破壞腫瘤細(xì)胞核的DNA雙鏈，經(jīng)過足夠的劑量和足夠的半衰期，能使腫瘤細(xì)胞全部失去繁殖能力，從而達(dá)到較徹底的治療效果。125I粒子組織間植入治療惡性腫瘤最早應(yīng)用于前列腺癌，后逐漸應(yīng)用于肺癌、消化道腫瘤、鼻咽癌及顱內(nèi)腫瘤[1-3]等，取得了較好的療效。近10年來，125I粒子組織間植入近距離治療肺癌的臨床應(yīng)用發(fā)展較快，植入技術(shù)日趨成熟，國內(nèi)外有學(xué)者[4-7]已對125I粒子植入治療非小細(xì)胞肺癌的療效和安全性進(jìn)行了探索，初步結(jié)果尚滿意，這種療法具有并發(fā)癥少、植入方式靈活、單個粒子射線量低、易于防護(hù)等優(yōu)點，有良好的發(fā)展前景。但目前國內(nèi)外還未見125I粒子對肺癌及正常肺組織影響的基礎(chǔ)研究報道。臨床應(yīng)用的劑量均是借鑒治療前列腺癌的劑量或參照外放射治療的劑量移植而來，治療劑量的確定缺乏理論依據(jù)。因此本文作者通過觀察不同劑量125I粒子對體外培養(yǎng)的人肺癌A549細(xì)胞系及人胚肺二倍體細(xì)胞系2BS生長的抑制作用，對比125I粒子對腫瘤細(xì)胞及正常肺細(xì)胞影響程度的不同，并分別繪制細(xì)胞生長曲線，以確定治療非小細(xì)胞肺癌的適當(dāng)劑量。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及實驗分組人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及人胚肺二倍體細(xì)胞系2BS，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，在含15%熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。放射性粒子6711型125I購自中國原子能科學(xué)院北京原博生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。本實驗選用0.2、0.4及0.8 mCi125I粒子分為低、中、高劑量組，以無粒子組、空粒子組分別作為陰性對照組及空白組。

1.2 單層細(xì)胞的培養(yǎng)傳代鏡下觀察細(xì)胞生長密度達(dá)80%以上時需要傳代。吸出培養(yǎng)皿中廢液，2 mL PBS沖洗，加進(jìn)混入EDTA 1∶1比例的胰蛋白酶2 mL，放入CO2孵育箱(溫度37℃，濕度5%)孵育2～3 min。貼壁細(xì)胞脫落后，及時用10%RPMI-1640培養(yǎng)液2 mL終止酶作用，鏡下觀察形成單個細(xì)胞懸液。然后離心，棄上清，重新加入10% RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀混勻，用細(xì)胞記數(shù)板鏡下記數(shù)估算濃度，一般在5×105mL-1為佳，重新加入培養(yǎng)皿中，加適當(dāng)10%RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞凍存方法為保持細(xì)胞活力及數(shù)量，一般在細(xì)胞生長對數(shù)期進(jìn)行凍存。培養(yǎng)傳代細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)期后，離心，棄上清，加入適量凍存液(無血清10%RPMI-1640培養(yǎng)液∶胎牛血清∶DMSO為7∶2∶1)，分裝在1.5 mL凍存管中，放入4℃冰箱，半小時后移置-20℃冰箱隔夜，最后放入-80℃冰箱或液氮罐長期保存。

1.4 細(xì)胞排染實驗細(xì)胞損傷或死亡后細(xì)胞膜完整性破壞。正常細(xì)胞拒染而死亡細(xì)胞則染成藍(lán)色。取100 μL細(xì)胞懸液加等量0.4%臺盼藍(lán)染色液，混合均勻，滴入血球計數(shù)板，穩(wěn)定2 min后進(jìn)行觀察，在5 min內(nèi)計數(shù)200個細(xì)胞?；罴?xì)胞不染色，死亡細(xì)胞呈藍(lán)色。將細(xì)胞生長抑制率[細(xì)胞生長抑制率= (對照組活細(xì)胞數(shù)-實驗組活細(xì)胞數(shù))/對照組活細(xì)胞數(shù)×100%]為Y軸，藥物濃度為X軸作圖，繪出劑量反映曲線，計算半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)值。

1.5 繪制細(xì)胞生長曲線選用對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞3×104mL-1于35 mm平皿。細(xì)胞置于5%CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，次晨皿上平鋪0.75%瓊脂，厚度約為0.5 cm，不同劑量125I粒子置入平皿中央。在第2、4、6及8天收集細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色，計數(shù)活細(xì)胞。每種處理于每個時間點設(shè)3個平行組，求均值及標(biāo)準(zhǔn)差，繪制細(xì)胞生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 體外細(xì)胞顯微鏡下觀察結(jié)果置入125I粒子后第4天，高劑量組125I粒子附近區(qū)域出現(xiàn)區(qū)域性低密度區(qū)。低及中劑量組未見明顯變化。第6天，在高劑量組125I粒子周圍0.8 cm范圍內(nèi)可見明顯細(xì)胞密度減少，細(xì)胞間隙增大，部分區(qū)域接近空白。此時，在中劑量組中可見125I粒子附近區(qū)域出現(xiàn)較明顯的區(qū)域性低密度區(qū)，低劑量組可見125I粒子附近區(qū)域出現(xiàn)輕微的密度減低區(qū)，對照組及空白劑量組中未見明顯細(xì)胞密度變化。

2.2 A549細(xì)胞和人胚肺二倍體細(xì)胞2BS生長曲線A549細(xì)胞在整個觀察期內(nèi)空白組、低劑量組和對照組的增殖趨勢極為接近，而中、高劑量組細(xì)胞增殖明顯受抑制，在第6天時最為明顯；對照組，空白，低、中及高劑量組細(xì)胞數(shù)(×104mL-1)分別為55.23±1.62、51.16±1.81、33.41±1.24、21.62±0.41及6.51±0.39，對照組細(xì)胞數(shù)分別為空白，低、中、高劑量組的1.079、1.653、2.554和8.484倍。中、高劑量組與對照組、空白組及低劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見圖1A?？瞻?，低、中劑量組和對照組的2BS細(xì)胞在整個觀察期內(nèi)增值趨勢極為接近；高劑量組的增值速度略有減緩。與A549細(xì)胞比較，在第6天這種減緩細(xì)胞增殖的作用并不十分明顯，對照組，空白，低、中、高劑量組細(xì)胞數(shù)(×104mL-1)分別為19.21±1.32、18.98±0.59、18.63±0.38、17.58±0.54及15.62±0.41；對照組細(xì)胞數(shù)分別是空白，低、中、高劑量組的1.012、1.031、1.092和1.230倍。各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1B。

A

B

2.3 A549和2BS細(xì)胞IC50的計算結(jié)果低、中、高劑量組A549細(xì)胞的抑制率分別為39.51%、60.85%和88.21%。將上述3組劑量所對應(yīng)的抑制率連接成線，得出近似直線方程為：Y=aX+b，其中Y為抑制率，X為對應(yīng)的劑量，a為系數(shù)，b為直線在Y軸上的截距。b=23.27，a=81.16。當(dāng)Y=50時，X=0.334，即125I粒子對A549細(xì)胞的IC50值≈0.4 mCi。同理，低、中、高劑量組對2BS細(xì)胞的抑制率分別為11.26%、13.14%和23.98%。得出125I粒子對2BS細(xì)胞的IC50值≈1.65 mCi。

3 討 論

125I粒子釋放的γ射線破壞腫瘤細(xì)胞核的DNA雙鏈，同時產(chǎn)生自由基使腫瘤細(xì)胞損傷，持續(xù)照射腫瘤細(xì)胞，使其氧增比減少、乏氧細(xì)胞減少，不斷地消耗腫瘤干細(xì)胞而使腫瘤細(xì)胞死亡，失去增殖能力[8-9]。對處于DNA合成后期及有絲分裂期階段的腫瘤細(xì)胞，少量的γ射線即能破壞其增殖能力；而處于增殖周期中其他階段的腫瘤細(xì)胞，對γ射線敏感度較差；靜止期的腫瘤細(xì)胞，對γ射線相對不敏感。腫瘤生長過程中只有一小部分細(xì)胞在持續(xù)增殖，因此分次、短時外照射只能對腫瘤繁殖周期中一部分時相的細(xì)胞起治療作用，亞致死損傷的細(xì)胞快速修復(fù)，不同周期間細(xì)胞再分布，存活的活性細(xì)胞繼續(xù)增殖，直接影響外照射的治療效果[10]。將放射性粒子植入到瘤體和瘤周，低能量、持續(xù)照射腫瘤細(xì)胞，可使亞致死損傷細(xì)胞的修復(fù)率顯著降低。因持續(xù)的組織間放射不可避免地影響著腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，將放大潛在致死損傷效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞處在不同的細(xì)胞周期，持續(xù)的照射可使較多處在敏感期的細(xì)胞被殺滅，使腫瘤細(xì)胞大部分遲滯于G2期[11-12]，有效控制腫瘤的再群體化。

本實驗中活度為0.2、0.4和0.8 mCi的125I粒子所輻射的γ射線造成的放射損傷多屬亞致死性損傷和潛在致死性損傷，由于125I粒子置入培養(yǎng)皿，腫瘤細(xì)胞受到持續(xù)性損傷，得不到自我修復(fù)的機(jī)會。A549細(xì)胞生長曲線顯示：高劑量組125I粒子對A549細(xì)胞有明顯的殺傷作用，中劑量組125I粒子對A549細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，低劑量組125I粒子對腫瘤細(xì)胞增殖抑制不明顯，可能是其活度偏低的緣故。2BS細(xì)胞生長曲線顯示：僅高劑量組125I粒子對細(xì)胞增殖有一定抑制作用，而低、中劑量組均無明顯抑制細(xì)胞增殖作用。本文作者認(rèn)為：正常組織對125I粒子所輻射的γ射線較為耐受，即要對正常組織產(chǎn)生放射損傷需要更高活度的125I粒子，這也是2BS細(xì)胞的IC50值遠(yuǎn)高于A549細(xì)胞的原因。

本研究結(jié)果表明：①體外實驗證實放射性125I粒子的活度為0.4 mCi時已對A549細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，0.8 mCi時殺傷效應(yīng)更強(qiáng)。故推薦臨床使用粒子的有效活度范圍是0.4～0.8 mCi。②放射性粒子125I對2BS細(xì)胞的IC50為1.6 mCi，臨床應(yīng)用放射性粒子125I的安全劑量應(yīng)為0.4～0.8 mCi。

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