萬法青,王 井,單玉興，張海玉

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部骨科，吉林 長春 130031；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒外科，吉林 長春 130021)

端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身RNA為模板合成端粒DNA序列，其結(jié)構(gòu)和行為的異常被認(rèn)為與細(xì)胞衰老及腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。目前有研究[1]表明：85%～95%的惡性腫瘤均有端粒酶的活性表達(dá)，而大多數(shù)體細(xì)胞無端粒酶活性。因此端粒酶可能成為治療腫瘤的新靶點(diǎn)。有學(xué)者[2]提出了以抑制端粒酶活性為目標(biāo)的腫瘤基因治療方案，希望能開發(fā)出抑制端粒酶活性或基因表達(dá)的抑制劑，從而達(dá)到治愈腫瘤的目的。骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，在原發(fā)性骨腫瘤中發(fā)病率最高，約占35%[3-4]，好發(fā)于青少年，是青少年死亡率和致死率最高的骨惡性腫瘤。近年來骨肉瘤化療藥物研究取得了一定的進(jìn)展[5-6]，但常因耐藥問題及副作用而影響療效，端粒酶的發(fā)現(xiàn)及其最新研究為骨肉瘤治療提供一種新的方法。齊多夫定(zidovudine,AZT)是一種核苷類似物，具有抗艾滋病作用，同時(shí)還可作為一種端粒酶抑制劑。國內(nèi)外有文獻(xiàn)[7-10]報(bào)道：AZT可以抑制肝癌細(xì)胞、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的端粒酶活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并可使HeLa細(xì)胞的端粒發(fā)生不可逆變的縮短,而AZT在骨肉瘤方面應(yīng)用的報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用AZT作用于骨肉瘤細(xì)胞株(HOS)，觀察其對腫瘤細(xì)胞生長及端粒酶活性的作用，旨在為端粒酶抑制劑更好地應(yīng)用于骨肉瘤及其他腫瘤的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及主要儀器人骨肉瘤細(xì)胞株(HOS)購自北京鼎國生物；MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；AZT為Sigma公司產(chǎn)品；四氮甲唑藍(lán)(MTT)和BCA蛋白試劑盒為碧云天公司產(chǎn)品；TRAP-PCR-ELISA試劑盒為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HOS細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HOS細(xì)胞分為AZT組和陰性對照組,分別加入100 μL經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的不同濃度(1、10、100及1 000 μmol·L-1) AZT及相同體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48和72 h后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在MTT實(shí)驗(yàn)中，加藥前后用倒置相差顯微鏡觀察各組培養(yǎng)孔內(nèi)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.4 MTT比色分析法取對數(shù)生長期細(xì)胞(制備細(xì)胞懸液為1×106mL-1)，接種于96孔板，每孔100 μL。設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對照組，次日分別加入100 μL經(jīng)培養(yǎng)液稀釋好的不同濃度(1、10、100及1 000 μmol·L-1)的AZT及相同體積的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48和72 h后加入MTT(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，終止培養(yǎng)，室溫振蕩約10 min，充分溶解藍(lán)紫色結(jié)晶。用Model-450酶標(biāo)儀(Bio-Bad)測定波長490 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%，細(xì)胞抑制率(%)=1-細(xì)胞存活率，抑制率達(dá)到50%為最佳作用時(shí)間和濃度,并作為下一步測定端粒酶活性改變的藥物濃度和作用時(shí)間。

1.5 TRAP-PCR-ELISA方法檢測端粒酶活性按試劑盒說明操作，具體步驟如下：收集細(xì)胞沉淀用冷洗液懸浮，冰浴5 min，4℃、10 000 r· min-1離心5 min，棄上清。沉淀與冷的裂解緩沖液冰浴30 min，其間渦旋振蕩3～5次，4℃、13 000 r·min-1離心 30 min，上清即所需的提取液，吸取上清液至一經(jīng)DEPC水處理的EP管中，分裝，20 μL/管，BCA法測定其中一份蛋白濃度，其余-70℃保存?zhèn)溆谩RAP-PCR反應(yīng)：在0.2 mL擴(kuò)增管中依次加入25 μL反應(yīng)混合物，3 μL細(xì)胞裂解產(chǎn)物，加無菌水至終體積50 μL。PCR步驟：25℃、30 min引物延伸；94℃、5 min端粒酶滅活；94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、90 s，共循環(huán)36個(gè)周期后72℃、10 min 進(jìn)一步延伸。4℃保存PCR產(chǎn)物。ELISA反應(yīng):PCR產(chǎn)物與變性劑以及雜交緩沖液反應(yīng)后，取100 μL加入有親合素包被的反應(yīng)孔中37℃振蕩孵育2 h。洗滌后，于各孔中加入抗地高辛-過氧化物酶，室溫下振蕩30 min。洗滌，再依次加入TMB和終止液，從酶標(biāo)儀上讀取其在450 nm處的A值。以65℃水浴10 min加熱滅活的HOS細(xì)胞提取液作為陰性對照，陽性對照由試劑盒內(nèi)提供。端粒酶活性下調(diào)率(% )=(實(shí)驗(yàn)組平均A值-對照組平均A值) /對照組平均A值×100%。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞貼壁生長，呈短梭形，細(xì)胞排列緊密，核較大，細(xì)胞密集時(shí)呈多層生長，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好；1 μmol·L-1AZT作用HOS細(xì)胞48 h后，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間隙變寬，可見少量細(xì)胞由瓶壁脫落并懸浮于培養(yǎng)液中，并可見少量細(xì)胞碎片，上述改變隨著AZT濃度的增加及時(shí)間的延長而更加明顯。HOS細(xì)胞與100 μmol·L-1AZT作用24 h后,細(xì)胞體積變小，由短梭形變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則形；48 h后細(xì)胞形態(tài)改變最顯著，細(xì)胞體積進(jìn)一步變小，細(xì)胞數(shù)量減少，部分貼壁的細(xì)胞皺縮并與鄰近細(xì)胞脫離，且瘤細(xì)胞大小不一，多呈單層生長；72 h后細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞變圓，皺縮，大部分細(xì)胞漂浮。見圖1(插頁三)。

2.2 AZT作用后HOS細(xì)胞存活率的變化不同濃度AZT對HOS細(xì)胞分別作用24、48和72 h后，細(xì)胞生長明顯抑制。以1、10、100和1 000 μmol·L-1AZT分別處理HOS細(xì)胞24、48和72 h后細(xì)胞存活率見表1。以對照組增殖率為(100.000±0.000)%，將不同濃度組的不同時(shí)間與對照組相比顯示：AZT可以明顯抑制HOS細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著濃度的增加及作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)(P<0.05)，呈時(shí)間和濃度依賴性。AZT對HOS細(xì)胞的半數(shù)致死濃度(IC50)為100 μmol·L-1。

2.3 AZT作用后端粒酶活性的變化對照組A值為1.236±0.22，AZT組A值為0.547±0.07。AZT組A值與對照組比較明顯降低(P<0.05)，AZT作用后HOS細(xì)胞端粒酶活性下降了55.74%,表明AZT對HOS細(xì)胞端粒酶活性有明顯的抑制作用。

表1 AZT作用后HOS細(xì)胞的存活率

3 討 論

端粒酶是細(xì)胞內(nèi)一種核糖蛋白，主要由RNA成分(hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白(hTEP)和催化亞單位 (hTERT)3部分組成[11]。其能以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長，以補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)染色體末端的縮短，解決“末端復(fù)制問題”，進(jìn)而穩(wěn)定端粒長度使細(xì)胞達(dá)到永生化。因此，抑制端粒酶活性在腫瘤治療中有重要作用。近年來有研究[12]報(bào)道：在84%的骨肉瘤、60%的軟骨肉瘤中可檢測到端粒酶活性的表達(dá)，而在瘤旁正常組織中卻檢測不到，這表明端粒酶活性是惡性腫瘤細(xì)胞的一種標(biāo)志，也表明抑制端粒酶活性可能成為治療骨肉瘤的一個(gè)新靶點(diǎn)。AZT作為端粒酶抑制劑可以和正常的單核苷酸競爭與RNA模板結(jié)合并抑制細(xì)胞內(nèi)部逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，在DNA復(fù)制時(shí)亦可摻入繼而使復(fù)制過程中止[13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn):AZT能抑制惡性腫瘤的端粒酶活性，縮短端粒，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。本研究中端粒酶活性下調(diào)率為55.74%，與AZT對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的端粒酶活性下調(diào)率一致[15]；1 μmol·L-1AZT作用于HOS細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖即受到抑制，該劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其在舌癌等細(xì)胞的應(yīng)用劑量，表明骨肉瘤細(xì)胞對AZT較敏感；隨著時(shí)間的延長及濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，100 μmol·L-1AZT作用于HOS細(xì)胞72 h時(shí)抑制率達(dá)到50%，當(dāng)1 000 μmol·L-1AZT作用于HOS細(xì)胞72 h時(shí)抑制率達(dá)到最高(90.92%)。有文獻(xiàn)報(bào)道：AZT可以阻滯腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于G1期，干擾逆轉(zhuǎn)錄過程從而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，AZT對HOS細(xì)胞增殖抑制作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：AZT對HOS細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，且呈時(shí)間和濃度依賴性，AZT具有抗骨肉瘤作用，有望成為治療骨肉瘤的一種新藥。

[參考文獻(xiàn)]

[1]邱廣斌,孫開來.端粒酶活性抑制與腫瘤治療的研究[J].國外醫(yī)學(xué)：遺傳學(xué)分冊,2000,23(3):127-129.

[2]黃 金,鄧興力,宋曉斌，等.逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT對膠質(zhì)瘤肝細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞增殖的影響[J].中國微侵襲神經(jīng)外科雜志,2011,16(10):470-473.

[3]Bacci G,Longhi A,Fagioli F,et al.Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities:27 year experience at Rizzoli Italy[J].Eur J Caner,2005,41(18):2836-2845.

[4]朱廣迎.放射腫瘤學(xué)[M].北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2009:76-80.

[5]Scotland K,Picci P,Kovar H.Targeted theralies in bone sarcomas [J].Curr Cancer Drug Targets,2009,9(7)：843-853.

[6]Bacci G，Lari S.Current treaunent of high grade osteosacoma of the extremity [J].J Chemother,2001,13(3):235-243.

[7]Chen C,Zhang Y,Wang Y,et al.Synergic effect of 3′ -azido-3′-deoxythymidine and arsenic trioxide in suppressing hepatoma cells[J].Anticancer Drugs，2011，22(5):435-443.

[8]Liu J,Wang Q,Yu SZ,et al.Azidothymidine inhibition of telomerase acticity and proliferation of TJ905 human glioblastoma cells[J].Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi，2009，38(3):183-188.

[9]陳 雯,張 橋，魏 青，等.端粒酶抑制劑對腫瘤細(xì)胞及其端粒酶活性的影響[J].腫瘤，2000,20(6)：415-418.

[10]Gomez DE,Tejera AM,Olive OA.Irreversible telomere shortening by 3′ -Azido-2′,3′-dideoxythmidine(AZT) treatment[J].Biochem Biophy Res Commun,1998,246(1):107-110.

[11]Nakamura TM,Morin GB,Chapman KB,et al.Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human [J].Science,1997,277(5328):955-959.

[12]Wen JM,Sun LB,Zhang M,et al.Anon-isotopic method for the detection of telomerase activityin tumour tissues: TRAP-silver staining assay[J].Mol Pathol,1998,51(2):110-112.

[13]于金海,劉國輝.AZT對胃癌細(xì)胞SGC7901端粒酶活性的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011,15(7):1064-1066.

[14]王建奇,韓艷華,柯以銓,等.端粒酶反義寡核苷酸及順鉑對惡性腦膠質(zhì)瘤治療的協(xié)同作用[J].腫瘤,2005,25(6):600-603.

[15]Liu SX,Sun WS,Cao CH,et al.Antisense oligonucleotide targeting at the initiation of hTERT arrests grouth of hepatoma cells[J].World J Gastroenterol，2004,10(3)：366-370.