包桂蘭，陳 勇，于 玲，李 敏，陳 霞

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 通遼 028000； 2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院藥理系，吉林 長(zhǎng)春130021)

氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是從豆科植物苦參、苦豆子和廣豆根等中藥中提取分離的一種喹喏里西啶類(lèi)生物堿。OMT的藥理作用廣泛，有研究者[1-3]報(bào)道了OMT對(duì)于大鼠缺血性腦損傷的干預(yù)作用，然而其干預(yù)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。大量研究[4-5]發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激與組織損傷密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究OMT對(duì)腦缺血性損傷干預(yù)作用的機(jī)制提供了線(xiàn)索。目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)OMT對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)干預(yù)作用的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察OMT對(duì)局灶性腦缺血大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，初步探討OMT對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑與主要儀器雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量240～270 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。OMT購(gòu)自寧夏鹽池紫荊花藥業(yè)有限公司(批號(hào)T8852-5mg)；路路通注射液購(gòu)自吉林省東北虎藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)D5879)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione-SH peroxydase，GSH-Px)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(批號(hào)770603)； 721分光光度計(jì)，南京第四分析儀器廠。LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。SSW型電熱恒溫水槽，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。電子天平，沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司。EG1160組織包埋機(jī)和Lecia Qwin圖像分析儀，德國(guó)徠卡儀器有限公司。LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)，瑞典LKB公司。

1.2 大鼠局灶性腦缺血模型的制備利用線(xiàn)栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。大鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，切開(kāi)右側(cè)頸部皮膚，剝離氣管及右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)上方的肌肉組織，分離并結(jié)扎右側(cè)CCA，在此過(guò)程避免破壞與右側(cè)CCA伴行的白色細(xì)長(zhǎng)迷走神經(jīng)，以防造成大鼠窒息而死。精細(xì)分離右側(cè)頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)，結(jié)扎ECA，并在ICA下方穿線(xiàn)備用。在右側(cè)CCA分叉處上方約4 mm處剪口，將直徑0.265 mm、長(zhǎng)度約4 cm 的魚(yú)線(xiàn)向大腦方向插入切口到頸內(nèi)動(dòng)脈中，當(dāng)插入的魚(yú)線(xiàn)最遠(yuǎn)端距右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處約18 mm為止。結(jié)扎ICA并縫合皮膚。術(shù)后37℃保溫，待動(dòng)物蘇醒。

1.3 動(dòng)物分組與給藥動(dòng)物購(gòu)入后穩(wěn)定1周，并保持飲食、飲水正常及晝夜節(jié)律正常。動(dòng)物隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組、OMT1(35 mg·kg-1)組、OMT2(70 mg·kg-1)組和OMT3(105 mg·kg-1)組，每組10只。各組動(dòng)物在造模前5 d 預(yù)防性腹腔注射給藥或生理鹽水。其中陽(yáng)性藥對(duì)照組腹腔注射給予路路通注射液100 mg·kg-1。路路通注射液的有效成分為三七總皂苷，給藥劑量以三七總皂苷的量計(jì)算。

1.4 神經(jīng)學(xué)評(píng)分術(shù)后24 h觀察大鼠狀態(tài)，對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，以判定神經(jīng)損傷情況及OMT干預(yù)作用。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢屈曲；2分，前肢屈曲對(duì)側(cè)抵抗推力下降；3分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識(shí)障礙。

1.5 TTC染色測(cè)量腦組織梗死體積比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉、斷頭后取出完整的大腦并施行冠狀切片，厚度約為2 mm。立即將切片置于1% TTC磷酸緩沖液中，37 ℃恒溫水浴避光孵育5～10 min后取出，置于10 %中性甲醛中固定。TTC為白色粉末，在合適的溫度及pH 值下可以與活細(xì)胞線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶作用，將正常組織染成紅色，而梗死區(qū)不被染色，故呈現(xiàn)白色。利用Leica Qwin圖像分析儀計(jì)算腦梗死體積比，計(jì)算公式為：腦梗死體積比 = 腦片梗死面積之和×腦片厚度/腦片總體積。

1.6 HE染色及腦組織形態(tài)學(xué)觀察將包埋腦組織的石蠟塊用切片機(jī)切片，厚度為5 μm。石蠟切片浸入水中展開(kāi)，將包含組織的石蠟切片剪下放在載玻片上。載玻片需事先用多聚賴(lài)氨酸處理以增加標(biāo)本對(duì)載玻片的附著力。石蠟切片用二甲苯脫蠟5 min×2，梯度濃度乙醇水合，PBS緩沖液浸泡5 min×2后，放入蘇木精染液浸染3～5 min；用PBS緩沖液沖洗后HE染色約10 min，用PBS緩沖液洗去多余染液。最后用梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，滴加中性樹(shù)膠封片。置10×20光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.7 血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量檢測(cè)大鼠腦缺血24 h后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，取血清分別按SOD、CAT、GSH-Px及MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，比色法測(cè)定吸光度(A)值后按公式計(jì)算出血清中各檢測(cè)指標(biāo)含量。

2 結(jié) 果

2.1 OMT作用后腦缺血大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分的變化大鼠腦缺血24 h后均表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙。癥狀較輕的表現(xiàn)為左下肢無(wú)力、提尾時(shí)雙側(cè)前肢不對(duì)稱(chēng)伸展等癥狀；癥狀較重的表現(xiàn)為向左側(cè)轉(zhuǎn)圈甚至出現(xiàn)意識(shí)障礙。預(yù)防性腹腔注射OMT后，OMT3組大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分顯著低于模型組(P<0.01)，OMT2組和OMT1組大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分均低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 OMT作用后腦缺血大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分和腦梗死體積比的變化

2.2 OMT作用后腦缺血大鼠腦梗死體積比的變化預(yù)防性腹腔注射OMT后，OMT3組大鼠腦梗死體積比顯著低于模型組(P<0.01)，OMT2組和OMT1組大鼠腦梗死體積比低于模型組(P<0.05)。陽(yáng)性藥組大鼠腦梗死體積比與OMT2組相當(dāng)，而OMT3組大鼠腦梗死體積比小于陽(yáng)性藥組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 OMT作用后腦缺血大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的變化光鏡下觀察：模型組大鼠腦梗死灶明顯，缺血區(qū)部分神經(jīng)元腫脹，體積變大，間質(zhì)水腫明顯，細(xì)胞及血管周?chē)g隙顯著增大；假手術(shù)組均無(wú)梗死灶，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無(wú)細(xì)胞水腫及間質(zhì)水腫；陽(yáng)性藥組大鼠梗死灶輕微，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)基本正常，細(xì)胞間有一定程度的水腫；OMT1組大鼠神經(jīng)細(xì)胞較為腫脹，有較為明顯的間質(zhì)水腫，壞死細(xì)胞數(shù)目較多，細(xì)胞及血管周?chē)g隙較大；OMT2組大鼠梗死灶較輕微，細(xì)胞水腫程度也有一定程度減輕，細(xì)胞壞死程度減輕；OMT3組大鼠神經(jīng)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的水腫程度較輕微，梗死灶較少，大部分細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整清晰。見(jiàn)圖1(插頁(yè)二)。

2.4 OMT作用后腦缺血大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的變化與模型組比較，OMT3組和OMT2組大鼠血清SOD活性明顯增加(P<0.01)，且隨著給藥劑量的增加,SOD的活性增加;OMT1組大鼠血清SOD的變化不明顯;陽(yáng)性藥組大鼠血清SOD活性與OMT3組和OMT2組相當(dāng)。與模型組比較，OMT3組和OMT2組大鼠血清CAT活性明顯增加(P<0.05)，且隨著給藥劑量的增加，CAT活性增加;OMT1組大鼠血清CAT的變化不明顯。與模型組比較，OMT3組和OMT2組大鼠血清GSH-Px活性明顯增加(P<0.01)，隨著給藥劑量的增加，GSH-Px活性增加；而OMT1組大鼠血清GSH-Px活性亦在一定程度上增加(P<0.05)。與模型組比較，OMT3組大鼠血清MDA含量明顯降低(P<0.01)，OMT2組MDA含量也降低(P<0.05)，OMT1組降低程度不明顯。見(jiàn)表2。

3 討 論

腦血管疾病是危害人類(lèi)健康的重要疾病，世界范圍內(nèi)的腦缺血患病和致殘致死率一直居高不下，因此，對(duì)腦缺血的發(fā)生機(jī)理和藥物治療進(jìn)行更深層次的探討意義重大。研究發(fā)現(xiàn)：氧化應(yīng)激是造成腦缺血損傷的重要病理生理機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明：術(shù)前預(yù)防性給予OMT能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能癥狀，促進(jìn)術(shù)后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，且具有較明顯的量效關(guān)系，隨給藥劑量的增加，OMT降低大鼠術(shù)后神經(jīng)學(xué)評(píng)分的作用逐漸增強(qiáng)。預(yù)防性給予OMT能夠降低大鼠局灶性腦缺血時(shí)腦梗死體積比，并且具有較明顯的量效關(guān)系，隨著給藥劑量的增加，OMT降低腦梗死體積比的作用逐漸增強(qiáng)。預(yù)防性給予OMT能夠減輕缺血腦組織和細(xì)胞的水腫程度，減少梗死灶，維護(hù)腦組織和細(xì)胞的形態(tài)正常，從而降低局灶性腦缺血時(shí)腦梗死體積比。降低程度具有較明顯的量效關(guān)系，隨著給藥劑量的增加，腦梗死體積比逐漸減小。

表2 OMT作用后大鼠血清SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的變化

機(jī)體內(nèi)承擔(dān)消除自由基的任務(wù)的酶類(lèi)主要包括SOD、CAT和GSH-Px[6-7]。這些酶再加上體內(nèi)維生素C和維生素E等還原性小分子化合物，共同構(gòu)成了抵御過(guò)氧化物和自由基損傷細(xì)胞和組織的屏障系統(tǒng)。因此，測(cè)定上述相關(guān)酶活性，就可以判定機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激的程度以及清除自由基能力的大小。本研究依靠上述相關(guān)酶的催化性能，利用比色法，測(cè)定了各組大鼠血清的酶活力，通過(guò)測(cè)定大鼠外周血清的SOD、CAT和GSH-Px活性，評(píng)價(jià)OMT對(duì)腦缺血大鼠氧化應(yīng)激的干預(yù)作用。結(jié)果表明：OMT可以提高SOD、CAT和GSH-Px活性，說(shuō)明OMT可能通過(guò)抑制腦缺血時(shí)的氧化應(yīng)激程度來(lái)干預(yù)腦缺血損傷。本研究中模型組大鼠外周血清的SOD、CAT和GSH-Px活性均較假手術(shù)組有明顯下降，提示腦缺血誘發(fā)了腦組織氧化應(yīng)激損傷；給予OMT后，3種酶的活性均有不同程度的恢復(fù)，有些組的恢復(fù)程度甚至超過(guò)了陽(yáng)性藥組，提示OMT對(duì)腦缺血大鼠的氧化應(yīng)激有抑制作用，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。這可能是OMT發(fā)揮腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。

另外，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，生物膜中不飽和脂肪酸的氧化作用導(dǎo)致脂自由基的形成和延伸反應(yīng)，而不飽和脂類(lèi)雙鍵的重排和膜脂的降解，形成了包括MDA在內(nèi)的降解產(chǎn)物，測(cè)定血清MDA的含量可以間接反映腦組織中氧自由基水平和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的強(qiáng)弱。本研究中模型組大鼠血清MDA含量較假手術(shù)組有明顯升高，提示腦缺血誘發(fā)了腦組織氧化應(yīng)激損傷，并導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用的增強(qiáng)，而機(jī)體清除自由基的能力大為減弱；給予OMT后，MDA含量隨著OMT劑量的增加而減少，證實(shí)其可以抑制MDA的生成，減輕機(jī)體過(guò)氧化損傷。

綜上所述，OMT可以通過(guò)增強(qiáng)SOD、CAT和GSH-Px的活性和抑制MDA的生成而促進(jìn)機(jī)體的自由基清除平衡，抑制自由基和脂過(guò)氧化物的聚集，進(jìn)而保護(hù)線(xiàn)粒體免于遭受進(jìn)一步的破壞，并最終發(fā)揮腦保護(hù)作用。

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