高羽亭，劉林華，黃明元，梁海榮，范洪學，唐煥文

(1.吉林大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室，吉林 長春 130021；2.廣東醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣東 東莞 523808；3.廣東醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院實驗中心，廣東 東莞 523808)

苯雖被列為確定的人類致癌物已近30年，但其仍是工業(yè)生產(chǎn)中重要的化工原料和溶劑。氫醌(HQ)是苯在生物體內(nèi)重要的中間代謝產(chǎn)物，流行病學及動物實驗發(fā)現(xiàn)：HQ慢性毒性作用靶器官為骨髓，而骨髓分為造血和基質(zhì)兩大系統(tǒng)[1]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作為多種骨髓基質(zhì)細胞的前體細胞是造血微環(huán)境的重要組成部分，是維持造血干細胞特性及歸巢到骨髓所必需的[2]。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]是DNA損傷引起的細胞早期應激反應的重要因子，參與許多重要的生命活動，如凋亡、轉錄、DNA修復、細胞死亡、染色體功能、基因組完整性和DNA甲基化等[3]。以往對HQ毒性效應的體外研究多選用肝細胞或動物的單核細胞，這些細胞與人骨髓中細胞的生物學特性有較大差異，不能反映HQ對靶器官的毒性作用，且主要研究高劑量HQ的毒效應[4-5]。本研究采用大鼠BMSCs為研究模型，探討低劑量HQ對BMSCs生物學性狀及PARP-1基因表達的影響，旨在闡明實際接觸水平下HQ對骨髓的毒效應，目前國內(nèi)外無相關報道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(四季青，杭州)；HQ(Sigma，美國)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(凱基，南京)；Trizol Reagent(Invitrogen，美國)；逆轉錄試劑盒(Fementas，立陶宛)；熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(Roche，德國);Cell Counting Kit-8試劑盒(Dojindo，日本)。

1.2 大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)

選用7 d齡Wistar乳鼠(購自南方醫(yī)科大學動物研究所，SPF級，體質(zhì)量約8～10 g，合格證號SCXK粵2009-0011)，頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離股骨，去除骨兩端，用5 mL低糖DMEM培養(yǎng)基，沖出骨髓于培養(yǎng)皿內(nèi)，收集細胞，吹打制成細胞懸液，用200目過濾網(wǎng)過濾為單細胞懸液。以1×105L-1接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)，約8～9 d細胞接近融合時，以質(zhì)量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，用血清終止消化。反復吹打瓶壁，制成單細胞懸液，按1.5×104mL-1傳代，每次傳代嚴格控制酶的量和消化時間，利用其易脫落的特點純化。第3代以后的細胞用于轉染實驗。

1.3 HQ染毒劑量的選擇

細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將HQ配制成系列終濃度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0和320.0 μmol·L-1)進行染毒，100 μL/孔，每個劑量設5個復孔，同時設PBS對照組。分別在24、48及72 h后用Cell Counting Kit-8試劑盒檢測，以細胞活力在75%以上為原則來選擇HQ劑量。

1.4 細胞活力及細胞增殖實驗

細胞按1×104/孔的密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，用PBS將HQ配制成系列終濃度(2.5、5.0和10.0 μmol·L-1)進行染毒，100 μL/孔，每個劑量設5個復孔，同時設PBS對照組和未染毒正常細胞對照組，即空白組。分別作用24、48和72 h后，每孔加10 μL Cell Counting Kit-8試劑，37 ℃溫育1 h，用全自動酶標儀在450 nm波長處測量各孔吸光度(A)值，并計算細胞活力，細胞活力(% )=(A實驗組-A空白組) /(APBS組-A空白組)×100%。以A值大小反映細胞增殖能力，A值越大，細胞增殖能力越強。

1.5 Annexin V/碘化丙啶(PI)雙標法檢測細胞凋亡率

細胞按4×105/孔的密度接種于 6孔板中，待細胞貼壁后，分別給予2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ進行染毒，同時設PBS對照組。作用48 h后用不含EDTA的胰酶消化，用PBS洗2次，2 000 r·min-1離心5 min,收集(1～5) ×105細胞，加入500 μL結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻，室溫避光反應5～15 min,1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 PARP-1基因mRNA表達水平檢測

1.6.1 細胞總RNA提取及完整性和純度鑒定 細胞按4×105/孔的密度接種于 6孔板中，待細胞貼壁后，分別給予2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ進行染毒，同時設PBS對照組。作用48 h后使用TRIzol試劑抽提細胞總RNA。紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測所得RNA純度和完整性。質(zhì)量分數(shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳顯示：樣品均含有28 S、18 S和5 S 3條條帶，其中28 S和18 S條帶清晰可見，且兩者的亮度比在正常范圍內(nèi)，A260/280均介于1.8～2.0，表明RNA樣品的完整性和純度可用于后續(xù)實驗。

1.6.2 逆轉錄合成cDNA 以RNA樣品為模板，進行逆轉錄反應制備cDNA。應用M-MMV逆轉錄酶，每份取1 μg總RNA進行cDNA合成，取隨機引物1 μL，5×buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor 1 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 2 μL，Revertaid M-MulV Reverse Transcriptase 1 μL，DEPC處理水至20 μL，42℃×60 min，70℃×5 min進行逆轉錄。

1.6.3 引物設計 按照目的基因的GenBank登錄號檢索得到基因的全長cDNA序列，利用Primer 5.0引物設計軟件根據(jù)標準熒光定量PCR引物設計原則，設計PAPR-1基因的引物，然后將設計出的引物輸入BLAST數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，最終得到具有特異性的引物序列。引物序列如下：PAPR-1上游PCR引物，5′-AGACCACGCACAATGCCTATGAC-3′；PARP-1下游引物，5′-GCAGTAGTTCGCACTTTTGGACAC-3′； ACTB上游PCR引物，5′-CAACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′；ACTB下游PCR引物，5′-GACCAGAGGCATACAGGGACAACA-3′；引物由上海英駿生物公司合成。

1.6.4 PARP-1的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 反應體系：3 μL逆轉錄產(chǎn)物，10 μL Master Mix，濃度為10 μmol·L-1的上游和下游引物各0.4 μL，dH2O 6.2 μL，總共20 μL。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，58℃退火40 s，共40個循環(huán)。融解曲線顯示為單峰，且峰形尖銳，說明擴增產(chǎn)物特異性良好，擴增過程中無引物二聚體形成，且DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示為單一條帶，說明引物符合qRT-PCR檢測的標準。采用比較Ct值法，以管家基因ACTB為內(nèi)參相對定量各實驗組樣品內(nèi)目的基因的表達水平，計算公式為：實驗組目的基因的相對表達量為2-△△Ct，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，ΔCt=CtPARP-1-CtACTB。每次實驗每個樣品設有3個平行孔，重復3次。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 HQ染毒劑量的選擇

圖1顯示：要保證細胞活力在75%以上，染毒劑量不能超過40.0 μmol·L-1。目前國標苯水平為6.0 mg·m-3，在實際生產(chǎn)過程中，很難達到20.0 μmol·L-1的骨髓蓄積量。因此染毒劑量為2.5～10.0 μmol·L-1更符合實際接觸水平。

圖1 不同劑量HQ作用24 h后BMSCs細胞活力的變化

2.2 HQ作用下BMSCs增殖能力的變化

分別用0、2.5、5.0及10.0 μmol·L-1HQ處理BMSCs，作用24、48及72 h后，各時間點各濃度HQ均可促進細胞增殖，且隨著HQ濃度增加細胞增殖能力明顯提高(P<0.05)。見表1。

2.3 HQ作用下細胞凋亡率的變化

HQ作用48 h后，與PBS組比較，5.0和10.0 μmol·L-1HQ組細胞早期凋亡率及晚期凋亡率和壞死率均明顯降低(P<0.05)，且晚期凋亡率和壞死率隨著劑量增加而降低。見表2。

2.4 HQ作用下BMSCs中PARP-1基因表達的變化

染毒48 h后，與PBS組(1.00±0.06)比較，2.5、5.0和10.0 μmol·L-1HQ組BMSCs中PARP-1的表達量分別為對照組的(0.92±0.06)、(0.56±0.05)(P<0.05)和(0.45±0.03)倍(P<0.05)，呈逐漸下降趨勢。

表1 不同劑量HQ作用不同時間后BMSCs增殖能力的變化

表2 不同劑量HQ作用48 h后BMSCs凋亡率的變化

3 討 論

1960—2003年我國職業(yè)人群平均苯接觸水平約為51.5 mg·m-3，苯接觸濃度在78.8 mg·m-3以內(nèi)的人群，血中HQ濃度不超過1.1 μmol·L-1。動物實驗[6]顯示：大鼠接觸濃度為1 595 mg·m-3的苯時，血中HQ濃度不超過1.8 μmol·L-1，骨髓中HQ濃度不超過60 μmol·L-1。隨著我國職業(yè)衛(wèi)生標準的不斷提高，目前苯作業(yè)人群骨髓中的HQ已很難達到20 μmol·L-1的蓄積量。因此選擇2.5 ～10.0 μmol·L-1作為染毒劑量更符合我國目前苯的職業(yè)接觸實際水平[7-8]。

間充質(zhì)干細胞在骨髓中能產(chǎn)生多種骨髓基質(zhì)細胞，構成造血微環(huán)境，并分泌多種造血相關因子及細胞外基質(zhì)蛋白維持和調(diào)節(jié)造血功能。研究[9]表明：HQ可通過caspase依賴及非caspase依賴的方式以及與TNFα發(fā)生協(xié)同作用，促進造血干細胞的凋亡。劉林華等[8]報道：低劑量HQ可促進TK6淋巴母細胞增殖，HQ作用24 h后細胞凋亡率和細胞增殖指數(shù)之間的改變趨勢相反。本實驗結果與該報道一致，各劑量組細胞增殖水平與PBS組比較明顯提高，5.0、10.0 μmol·L-1HQ組細胞與PBS組比較，無論是早期凋亡率還是晚期凋亡和壞死率都明顯降低，說明低劑量HQ能抑制細胞凋亡，促進細胞的增殖。但凋亡的抑制可延長異常細胞存活，創(chuàng)造了不穩(wěn)定基因的環(huán)境，可促進腫瘤的發(fā)生。HQ在體內(nèi)何時發(fā)揮誘導凋亡，何時發(fā)生抑制凋亡的作用，可能與其作用的劑量、時間及不同受試細胞有關，與啟動不同的血液毒性效應及其血液毒性表現(xiàn)多樣性有關。

PARP-1在應對遺傳毒性反應過程中發(fā)揮重要作用，如參與 DNA 損傷修復、維持基因組穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)基因轉錄以及細胞凋亡過程等[10]。在腫瘤的形成過程中，時常伴有PARP-1基因的失活，導致基因突變率增高、基因組穩(wěn)定性下降和細胞凋亡障礙。苯暴露可導致人類白血病，HQ 是苯的重要代謝產(chǎn)物之一，具有強氧化性，能夠引起細胞 DNA 單鏈斷裂，導致腫瘤相關基因失活或激活。本實驗結果顯示：PARP-1表達量與細胞凋亡的改變趨勢相同，與細胞增殖趨勢相反，提示PARP-1可能參與HQ誘導的凋亡抑制和細胞增殖。劉林華等[11]研究發(fā)現(xiàn)：低劑量HQ處理TK6細胞48 h后，PARP-1蛋白隨劑量增加呈下降趨勢，并認為PARP-1啟動子區(qū)的甲基化相關基因MBD2可能在HQ誘導的PARP-1蛋白下調(diào)過程中發(fā)揮一定作用。Gao等[12]發(fā)現(xiàn)：在F32淋巴母細胞中，苯致PARP-1 mRNA 表達水平下降與PARP-1啟動子區(qū)的高甲基化有關。本實驗結果雖提示PARP-1可能參與細胞的增殖和凋亡過程，但進一步的證據(jù)以及其表達水平下調(diào)的機制還有待深入研究。

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