張紅艷，王春玉，姚 遠(yuǎn)，李彥姝，王 迪，李 豐

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室 衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧 沈陽(yáng) 110001;2.遼寧省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族是一類(lèi)作用繁多的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞外基質(zhì)改建及胚胎發(fā)育等多種細(xì)胞活動(dòng)，并在多種疾病尤其是腫瘤、纖維變性類(lèi)疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病中扮演著重要角色[1-2]。TGF-β超家族包括TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和活化素(activins)等亞類(lèi)，可以通過(guò)激活多個(gè)下游信號(hào)通路行使其功能，其中Smads信號(hào)通路被認(rèn)為是最關(guān)鍵的。Smads蛋白家族包括8個(gè)成員，分為R-Smads，Co-Smad和I-Smads 3類(lèi)[3]。R-Smads包括Smad1/2/3/5/8，能夠與受體結(jié)合并被受體磷酸化而激活；Co-Smad指Smad4，能夠與活化了的R-Smads結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體可進(jìn)核結(jié)合DNA并與多種轉(zhuǎn)錄輔因子共同作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；I-Smads包括Smad6/7，作為R-Smads的競(jìng)爭(zhēng)性抑制子，負(fù)向調(diào)控TGF-β通路。TGF-β信號(hào)通路受精密的調(diào)控，不同的上游配體激活不同的下游分子。TGF-β1屬于TGF-β超家族的TGF-β亞類(lèi)，Smad2/3/4參與該信號(hào)通路。Smad2/3/4在細(xì)胞質(zhì)中與多種蛋白相互作用，如SARA[4]和PDK1[5]等。作為T(mén)GF-β1通路的重要下游蛋白，Smad2/3/4與某些相互作用蛋白的結(jié)合受TGF-β1調(diào)控。在TGF-β1作用下，PDK1與Smad2/3/4的結(jié)合減弱[5]；而Smad2與SARA的結(jié)合依賴(lài)于TGF-β1刺激[4]。本研究旨在利用基因重組技術(shù)構(gòu)建pcDNA3.1myc-HisA Smad2/3/4真核表達(dá)質(zhì)粒，使用標(biāo)簽抗體建檢測(cè)Smad2/3/4在細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)使用標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫沉淀，質(zhì)譜分析Smad2/3/4新的相互作用蛋白，進(jìn)一步探索其生物學(xué)功能及在TGF-β信號(hào)通路中的功能。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒大腸桿菌DH5α感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備；HEK293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA3.1myc-HisA載體購(gòu)自Invitrogen公司，pcDNA3.1-Smad2/3受贈(zèng)于Sabelle van Seuningen教授，pGEX2T-Smad4受贈(zèng)于Koichi Shimada教授。

1.2 試 劑PyrobestTMDNA polymerase、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和KpnⅠ均購(gòu)自大連 TaKaRa公司；質(zhì)粒提取及DNA電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；DNA 和蛋白 marker購(gòu)自GenScript公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；Myc抗體購(gòu)自Santa公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；引物合成和DNA測(cè)序測(cè)定由Invitrogen公司完成；Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM及胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自GE Healthcare 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 Smad2/3/4全長(zhǎng)基因擴(kuò)增設(shè)計(jì)Smad2/3/4擴(kuò)增的PCR引物，并在引物中加入EcoRⅠ和KpnⅠ2個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。引物序列見(jiàn)表1。以質(zhì)粒為模板，利用pyrobest酶，通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得Smad2/3/4全長(zhǎng)編碼序列。

表1 引物序列及酶切位點(diǎn)

1.4 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4表達(dá)載體的構(gòu)建將pcDNA3.1myc-HisA載體和Smad2/3/4 PCR片段用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠回收純化產(chǎn)物。回收產(chǎn)物摩爾比按照1∶5(載體∶片段 )比例，利用T4 DNA連接酶，將2個(gè)片段常溫連接2 h，然后16℃連接過(guò)夜，取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂于LB/Amp平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取菌落，接種于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜。一部分菌液用來(lái)保存菌種，另一部分用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定外源基因的插入，質(zhì)粒DNA送Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.5 pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系HEK293細(xì)胞用10%胎牛血清的高糖DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞鋪于6孔板至70% ～ 80%融合，按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染6孔板的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 蛋白質(zhì)提取與Western blotting鑒定轉(zhuǎn)染24 h后，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗2次。在細(xì)胞中加入60 μL含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細(xì)胞緩慢刮下。收集所有液體至新的離心管中，冰上放置10 min，裂解細(xì)胞。13 000 g、4℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，取上清5 μL，利用考馬斯亮藍(lán)G250染液和0.5 g·L-1BSA，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)量595 nm的吸光度(A)值，以結(jié)果做直線(xiàn)回歸方程:Y = aX + b。測(cè)量蛋白樣品與對(duì)照在595 nm的A值，差值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，求出相應(yīng)蛋白濃度。

將蛋白定量后，取80 μg總蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠分離，4℃過(guò)夜，40 V恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h。用Flag抗體(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶5 000稀釋)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影，Western blotting成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增Smad2/3/4基因全長(zhǎng)以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4質(zhì)粒為模板，特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增Smad2/3/4基因全長(zhǎng)。擴(kuò)增條件為95℃、5 min預(yù)變性；95℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃、10 min，溫度降至4℃。1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色后，在紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。見(jiàn)圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的構(gòu)建及鑒定每個(gè)質(zhì)粒挑取2個(gè)克隆，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切后，圖2中1和2泳道為Smad2，得到5 400和1 401 bp 的2條帶；3和4泳道為Smad3，得到5 400和1 275 bp的2條帶；5和6泳道為Smad4，5泳道得到5 400和1 656 bp的2條帶，6泳道未得到目的片段。重組質(zhì)粒的酶切鑒定表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，經(jīng)過(guò)測(cè)序分析，外源系列在NCBI-Blast比對(duì)結(jié)果與Smad2/3/4編碼序列一致。

圖1 Smad2/3/4基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4酶切分析

2.3 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)分別將pcDNA3.1myc-HisA空載和pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4，有一明顯條帶(圖3)，空載體對(duì)照組未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，結(jié)果表明構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中表達(dá)。

3 討 論

TGF-β對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。在腫瘤早期，可以抑制腫瘤的發(fā)生。但是，在腫瘤晚期，TGF-β1的生長(zhǎng)抑制作用被限制，并通過(guò)引起細(xì)胞的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)癌細(xì)胞遷移和侵襲[6]。一些腫瘤中存在TGF-β信號(hào)通路蛋白(如TβRⅡ，Smad4)的突變，從而逃避TGF-β引起的生長(zhǎng)抑制。利用細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：僅40%的胃癌細(xì)胞中存在TGF-β信號(hào)通路蛋白的突變，但在外源轉(zhuǎn)入突變蛋白對(duì)應(yīng)的野生型蛋白后，其中75%的細(xì)胞仍然不能恢復(fù)對(duì)TGF-β的反應(yīng)性，這提示胃癌細(xì)胞內(nèi)存在重要的TGF-β通路抑制因子。有學(xué)者[7-8]發(fā)現(xiàn)一些TGF-β通路的抑制因子，如在骨髓瘤中CDK2通過(guò)磷酸化Smad2的MH1區(qū)破壞TGF-β引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能；Cam kinaseⅡ通過(guò)磷酸化Smad2/3/4抑制TGF-β/Smads的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能；PKB通過(guò)結(jié)合Smad3抑制其轉(zhuǎn)錄活性及核轉(zhuǎn)位。但是，還可能存在未被發(fā)現(xiàn)的TGF-β通路抑制因子。

圖3 Western blotting檢測(cè)pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4 融合蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)典的Smads信號(hào)通路是TGF-β作為配體與相應(yīng)膜受體結(jié)合，進(jìn)而激活相應(yīng)下游信號(hào)蛋白Smads，行使對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能，形成一個(gè)嚴(yán)格而精密的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。TGF-β1屬于TGF 超家族的TGF 亞類(lèi)，能夠結(jié)合并激活細(xì)胞膜上的TGF-β受體Ⅱ(TβRⅡ)，活化的TβRⅡ進(jìn)而結(jié)合并磷酸化同樣位于細(xì)胞膜上的TGF-β受體Ⅰ(TβRⅠ，AKL5)。具有活性的受體復(fù)合體形成后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smad2/3 C末端的SSXS序列被TβRⅠ磷酸化，與Smad4形成復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核并行使基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能[9]。

最近有研究表明：雖然經(jīng)典的Smads作用是由R-Smads與Smad4形成復(fù)合體來(lái)完成，但也存在不依賴(lài)Smad4的情況。在角質(zhì)細(xì)胞中，IKKalpha能夠結(jié)合Smad2/3并促進(jìn)Mad1、Mad2等介導(dǎo)TGF-β引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制基因的表達(dá)，這種促進(jìn)不依賴(lài)于Smad4[10]。在造血干細(xì)胞中，核蛋白轉(zhuǎn)錄中介因子1γ(TIF1γ)能夠與Smad4競(jìng)爭(zhēng)和Smad2/3的結(jié)合，介導(dǎo)TGF-β/Smads引起的不同作用：Smad2/3-TIF1γ介導(dǎo)細(xì)胞分化，而Smad2/3-Smad4介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制[11]。

目前，腫瘤已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重要疾病，其發(fā)病率逐年上升，但其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全闡明，TGF-β/ Smads 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在機(jī)體組織中生物學(xué)作用廣泛,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用DNA重組技術(shù)將Smad2/3/4重組到pcDNA3.1myc-HisA載體中，通過(guò)酶切和測(cè)序保證擴(kuò)增片段的正確性，并采用Western blotting方法證實(shí)融合蛋白的表達(dá)。融合蛋白中含有myc標(biāo)簽，可用于目標(biāo)蛋白的純化和檢測(cè)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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