林曉晨，楊 鑫，曹宇航，焦 麗，戴 甄，任林柱，逄大欣

(吉林大學畜牧獸醫(yī)學院 動物胚胎工程吉林省重點實驗室，吉林 長春 130062)

CD4是一種跨膜糖蛋白，主要表達于輔助T細胞表面，是TCR識別抗原的供受體，與MHCⅡ類分子多肽區(qū)結合[1]。目前已克隆鑒定了人、猴、鼠、兔、牛、貓、狗等動物的CD4-DNA序列。20世紀80年代，應用單克隆抗體的免疫組織化學技術與流式細胞技術在豬的T淋巴細胞表面鑒定了CD4分子。CD4基因的表達受到多基因的控制[2]，其中包括啟動子、增強子及沉默子等調控元件[3]。為了能使CD4基因更好地表達，使其他物種啟動子為人類疾病研究起到輔助作用，CD4基因調控原件的研究一直成為研究重點。CD4分子以單體的形式存在，CD4+T 細胞能識別MHCⅠ類分子遞呈的抗原，它們除了作為細胞黏連分子發(fā)揮作用外,還是傳遞信號的分子,具有信號傳遞功能[4-5]?；蜣D錄是遺傳信息傳遞和表達的樞紐，是基因表達調控機制發(fā)揮作用的重要環(huán)節(jié)[1]。而啟動子是決定轉錄起始點和轉錄頻率的關鍵元件，因此啟動子的識別對整個基因組功能的詮釋具有重要作用[6]。啟動子的研究對于闡釋基因表達調控網(wǎng)絡的機制和基因組的功能都具有非常重要的意義。啟動子的結構影響了其與RNA聚合酶的親和力，從而影響基因表達水平。轉錄單元(transcription unit) 是一段從啟動子開始至終止子(terminator)結束的DNA序列，RNA聚合酶從轉錄起點開始沿著模板前進，直到終止子為止，轉錄出一條RNA鏈。在細胞中，一個轉錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。啟動子區(qū)是RNA聚合酶的結合區(qū)，其結構直接關系到轉錄的效率[7-8]。研究啟動子，也就是要研究其在細胞中啟動外源基因的能力，而對于較難轉染的細胞來說，現(xiàn)在有—種新型的轉染方式——慢病毒侵染。慢病毒載體是HIV-1源性的復制缺陷型逆轉錄病毒，采用表達VSV包膜蛋白取代了HIV本身包膜蛋白，使其大大提高了轉導效率，并擴展了感染宿主細胞的范圍，能感染所有組織來源的分裂和非分裂細胞，攜帶的目的基因能整合到宿主細胞基因組，使得外源基因獲得長期穩(wěn)定表達。目前，體內外實驗中均未發(fā)現(xiàn)慢病毒載體對正常組織細胞有毒副作用。本實驗通過慢病毒表達載體研究異種基因啟動子在Jurkat細胞中調節(jié)外源基因表達的作用，該系統(tǒng)能在較長時間里明顯地觀察到外源基因的表達情況，本實驗旨在為建立人類白血病動物模型奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

PGM-T載體購自Invitrogen公司；Tag酶 T4DNA聚合酶和T4DNA連接酶購自 TAKARA公司；質粒小抽試劑盒 膠回收試劑盒和無內毒素質粒大抽試劑盒購自TIANGEN公司；NotⅠ 和EcoRⅠ 購自TAKARA公司；慢病毒包裝系統(tǒng)和293T包裝細胞購自Cell biolabs公司；Jurkat細胞由吉林大學白求恩醫(yī)學院免疫學實驗室提供；RPMI 1640、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺、 非必需氨基酸、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶均購自美國Invitrogen公司；質粒小抽試劑盒、膠回收試劑盒和無內毒素質粒大抽試劑盒均購自 TIANGEN公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；引物由北京TIANGEN公司合成。

1.2 引物設計合成

根據(jù)查找的豬CD4基因序列進行設計，SALMON等[8]已經(jīng)得出人和大鼠CD4基因啟動子具有相同的5對保守序列。首先查找豬CD4全序列，通過5對保守序列與豬CD4基因前1 400 bp比較，發(fā)現(xiàn)豬基因組中也同樣包含有與人、鼠相同的保守序列。另外，由于家豬與野豬在CD4基因啟動子與增強子序列上存在差別，所以通過啟動子在線分析軟件和從文獻中得到的序列，獲得家豬可能的啟動子與增強子范圍，利用引物設計軟件Primer 5.0設計引物，上游：5′-GCGGCCGCGATCTCCAGAGATCAAACC-3′;下游：5′-GAATTCAAGCGAGTCTCTGCAGAAGTA -3′,在上、下游引物加入NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點(下劃線部分)，并由北京TIANGEN公司合成。

1.3 基因的克隆及載體的構建

提取長白豬的血液基因組作為PCR模板，利用6對引物進行PCR，反應體系為E*Tag0.5 μL，模板1 μL，引物各1 μL，DNTP 4 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 37.5 μL，共50 μL。得到的產物回收并連接到PGM-T載體上進行測序。將測序結果與查找結果進行比對，并與豬全基因組進行比對，分析該片段是否正確。將慢病毒包裝系統(tǒng)主質粒PSMPUW的啟動子EF-1α利用NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點切掉，連入已經(jīng)克隆得到的豬CD4基因啟動子，得到載體PSMPUW-SP，并比對確認連入的片段是否出現(xiàn)偏差。用此載體進行慢病毒包裝級檢驗實驗。

1.4 細胞培養(yǎng)

Jurkat細胞株，于37℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含有10%FBS、1%雙抗、1%谷氨酰胺替代物和1%非必須氨基酸的RPMI 1640培養(yǎng)基。Jurkat細胞為懸浮培養(yǎng)的癌細胞，生長速度很快，1～2 d就必須傳代1次。否則其培養(yǎng)基很難滿足其消耗致使細胞可能出現(xiàn)大量死亡或者生長狀態(tài)緩慢。293T細胞株，半懸浮半貼壁細胞，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為包含有10%FBS,1%雙抗，1%谷氨酰胺替代物，1%非必須氨基酸的DMEM培養(yǎng)基。

1.5 慢病毒包裝、測定及侵染

1.5.1 慢病毒的包裝 提前1 d將293T細胞接種到6孔板，當細胞達到70%～80%匯合時進行實驗。利用DPBS清洗選定的轉染孔2次，重新加入新鮮培養(yǎng)基待用。將慢病毒主質粒和輔助質粒以3∶1∶1∶1比例與相應體積的Opti-MEM混合均勻，與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，形成DNA與Lipofectamine 2000的轉染復合物。將Lipofectamine 2000-DNA轉染復合物加入到準備好的293T細胞中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6～8 h后換入帶有10%FBS的培養(yǎng)液。24和48 h后綠色熒光顯微鏡下檢測轉染效率，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉染后48 h的293T細胞上清液，于4℃、4 000 r·min-1離心10 min，除去細胞碎片。以0.45 μm皿濾器過濾上清液于15 mL離心管中。放于-70℃保存待用。

1.5.2 慢病毒滴度的測定和侵染 在青霉素瓶或離心管中將保存的含有病毒的上清液作連續(xù)5倍的稀釋，從10-1到10-5。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔加入細胞懸液100 μL，使細胞量達到(2～3)×105mL-1。設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排(100 μL生長液+100 μL細胞懸液)。逐日觀察并記錄出現(xiàn)陽性結果的孔數(shù)，一般需要觀察5～7 d。根據(jù)下列公式計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。Reed-Muench兩氏法：距離比例=(高于50%的病變率的百分數(shù)-50%)/(高于50%的病變率的百分數(shù)-低于50%的病變率的百分數(shù))；lgTCID50=距離比例×稀釋倍數(shù)之間的差+高于50%的病變率的稀釋對數(shù)。Karber法：lgTCID50=最高稀釋度的對數(shù)-稀釋度對數(shù)之間的差×(陽性孔比率總和-0.5)。

將Jurkat細胞計數(shù)，選取(1～2)×105的細胞換液后加入到24孔板中，20～24 h選取細胞最佳生長狀態(tài)時，將細胞培養(yǎng)液完全換成包涵病毒的培養(yǎng)液。左右輕搖細胞使細胞達到均勻分布為最佳，置于37℃ 、5% CO2條件下培養(yǎng)24～48 h后綠色熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結 果

2.1 豬CD4啟動子的克隆及慢病毒載體的構建

利用啟動子在線分析軟件查找前1 400 bp片段序列可能出現(xiàn)啟動子的位置，見圖1。由此設計引物，以血液提取出的基因組作為模板進行PCR反應，得到豬CD4啟動子序列，并且將PCR產物連接T載體，得到PGM-T-SP，進行測序并鑒定，鑒定結果見圖2。由于家豬與野豬基因不同，得到的結果與查找得到野豬的基因相似度在50%以上，得到的PCR產物包含5對保守序列。將得到的豬CD4基因啟動子片段利用NotⅠ和EcoRⅠ 2個酶切位點與利用2個酶切位點切掉啟動子的慢病毒主質粒進行連接，得到PSMPUW-SP，將其轉化至TOP10感受態(tài)后經(jīng)KAN抗性篩選陽性質粒，提取質粒后進行酶切鑒定，鑒定結果見圖3。慢病毒表達載體的構建結果見圖4。

圖1 全基因前1 400 bp序列預測出的啟動子位置

圖2 SP的PCR結果(A) 和PGM-T-SP的鑒定結果(B)

圖3 PSMPUW-SP的酶切鑒定結果

2.2 慢病毒包裝結果

培養(yǎng)的293T細胞包裝病毒后，利用綠色熒光顯微鏡進行觀察，攜帶CD4基因啟動子的慢病毒包裝體系中的主質粒進入到293T細胞中，綠色熒光表達量很明顯。相對于EF-1α啟動子啟動的原質粒,豬CD4基因啟動子在293T細胞中能更好地表達。CD4基因啟動子與EF-1α啟動子在293T細胞中的啟動效果沒有很大差別，說明豬CD4基因啟動子啟動的高效性。見圖5(封二)。

2.3 慢病毒滴度測定

結果顯示：病毒稀釋液濃度為10-1時出現(xiàn)8個陽性孔數(shù)，10-2時出現(xiàn)8個陽性孔數(shù)，10-3時出現(xiàn)6個陽性孔數(shù)，10-4時出現(xiàn)3個陽性孔數(shù)，10-5時出現(xiàn)0個陽性孔數(shù)；通過累加，病毒稀釋液濃度為10-1～10-5時分別出現(xiàn)25、17、11、3和0個陽性孔數(shù)。由此計算陽性孔數(shù)占總孔數(shù)的比例，10-1～10-5分別為100.0%、100.0%、84.6%、30.0%和0%。根據(jù)公式計算，Reed-Muench兩氏法：距離比例(84.6-50.0)/(84.6-30.0)=0.6，lgTCID50=0.6×(-1)+(-3)=-3.6,即TCID50=10-3.6·0.1 mL-1。Karber法：lgTCID50=-1-1×(3.125-0.5)=-3.625,同樣可以說明TCID50=10-3.6·0.1 mL-1。綜合2種計算結果得出大概的病毒量為10-3.6·0.1 mL-1。

圖4 慢病毒表達載體構建示意圖

2.4 侵染結果照相

利用包裝出來的病毒侵染了2種細胞，侵染的293T細胞中可見成功包裝的慢病毒，見圖6(封二)。雖然包裝出來的病毒并沒有達到理想值，但其感染效果很明顯，綠色熒光表達很好，而且慢病毒表達時間較長的特性也能利于更好地觀測和得出結論。從侵染Jurkat細胞后對綠色熒光蛋白的觀察可見：CD4基因啟動子包裝出來的病毒與EF-1α啟動子包裝出來的病毒的陽性病毒相近，見圖7(封二)。結果顯示：克隆得到的豬CD4基因啟動子也許并非是一種特異性啟動子，其與人、大鼠CD4基因啟動子從遺傳特性上有著很大的不同。2種細胞侵染結果對比顯示：Jurkat細胞具有難轉染的特性，普通的轉染試劑很難達到效果。

3 討 論

豬作為一種模型生物有著很多優(yōu)點，并且越來越受到研究人員的關注，其生理特征和病理特征均可以作為研究的對象。本實驗對豬CD4基因啟動子進行預測及克隆，并采用慢病毒表達載體對克隆得到的啟動子進行驗證[9]。結果顯示其在293T細胞中可以大量表達，而且在Jurkat細胞中得到了同樣的結論。雖然人和大鼠的CD4基因啟動子在淋巴細胞中能夠特異表達，但研究發(fā)現(xiàn):豬CD4基因啟動子也許并非是一種特異性啟動子。目前，區(qū)別特異性啟動子與非特異性啟動子的方法，均是以基因在某種特定細胞中的表達量的多少來區(qū)分。以CMV啟動子為例，CMV啟動子來源于病毒,相對與內源性的啟動子，在哺乳動物細胞中CMV啟動子表達可能更易于受到細胞內沉默機制的影響[10]。CMV啟動子序列中含有NFκB 結合位點，NF 位點可以明顯增強CMV 啟動子啟動基因序列的表達水平[11]，然而CMV啟動子啟動外源基因表達并非是最好的選擇，真核基因的表達調控是一個復雜的動態(tài)過程，在轉錄起始、轉錄延伸和轉錄終止的循環(huán)中，每一個細節(jié)都受到精細而復雜的調控。基因啟動子在轉錄起始過程中發(fā)揮重要的調控作用，其能夠被很多反式作用因子識別，在不同細胞中，同一個啟動子因相互作用的反式作用因子不同,基因的表達水平也不同。而在同一細胞中，相同反式作用因子對不同啟動子的識別序列不一致。在某些細胞中這些組成型啟動子驅動的基因表達強度存在著差異。在小鼠胚胎干細胞中 CMV啟動子驅動基因的表達能力很弱,而伴隨著細胞的分化,CMV驅動基因的表達能力明顯增加。因此在目的細胞中篩選最適啟動子非常必要，轉錄起始的能力也并不相同。雖然在很多細胞中CMV啟動基因的表達效果最強，然而許多實驗[12-14]結果表明:CMV啟動子并不能在機體組織中長期持續(xù)表達。

如果說CMV并非特異性，那么是否也可以將在人癌細胞中同樣高表達的豬CD4基因啟動子作為非特異性啟動子?本實驗結果顯示:豬CD4基因啟動子和EF-1α啟動子啟動綠色熒光蛋白在細胞中表達量雖然有所不同，但總體趨勢不變。SP與EF-1α在相同細胞當中有著同樣的表達效果。豬CD4基因啟動子與已經(jīng)確定的人、鼠CD4基因特異性啟動子有區(qū)別，空間結構的不確定，反式作用因子的識別等都是制約啟動子在細胞中發(fā)揮作用的因素。實驗結果顯示真核細胞基因啟動子在細胞中的轉錄的空間結構和轉錄后修飾狀態(tài)是一定的，不同物種之間啟動子在細胞中的表觀遺傳學修飾狀態(tài)可能導致其驅動基因表達能力存在差異。本研究確定了豬CD4基因啟動子的序列和其在293T和Jurkat細胞中啟動綠色熒光蛋白基因的表達效果，在人類白血病癌細胞Jurkat中,CD4基因啟動子啟動效果與EF-1α啟動子啟動效果比較差別不大。可以得到這樣的結論：豬CD4基因啟動子并非具有特異性。

[參考文獻]

[1]Itano A,Salmon P,Kioussis D,et al.The cytoplasmic domain of CD4 promotes the development of CD4 lineage T cells [J].J Exp Med,1996,183(3):731-741.

[2]Sarafova S,Siu G.Precise arrangement of factor-binding sites is required for murine CD4 promoter function [J].Nucleic Acids Res,2000,28(14):2664-2671.

[3]Wurster AL,Siu G,Leiden JM,et al.Elf-1 binds to a critical element in a second CD4 enhancer [J].Mol Cell Biol,1994,14(10):6452-6463.

[4]Chong MM,Simpson N,Ciofani M,et al.Epigenetic propagation of CD4 expression is established by the CD4 proximal enhancer in helper T cells [J].Genes Dev,2010,24(7):659-669.

[5]Duncan DD,Stupakoff A,Hedrick SM,et al.A Myc-associated zinc finger protein binding site is one of four important functional regions in the CD4 promoter [J].Mol Cell Biol,1995,15(6):3179-3186.

[6]Sarafova S,Siu G.A potential role for Elf-1 in CD4 promoter function [J].J Biol Chem,1999,274(23):16126-16134.

[7]Lo SF,Wan L,Lin HC,et al.Association of CD4 enhancer gene polymorphisms with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus in Taiwan [J].J Rheumatol,2008,35(11):2113-2118.

[8]Salmon P,Giovane A,Wasylyk B,et al.Characterization of the human CD4 gene promoter: transcription from the CD4 gene core promoter is tissue-specific and is activated by Ets proteins [J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(16):7739-7743.

[9]李振宇，徐開林，潘秀英，等.慢病毒載體介導綠色熒光蛋白基因在小鼠T淋巴細胞中的表達 [J].中國實驗血液學雜志，2007，15(1)：125-128.

[10]Gill DR,Smyth SE,Goddard CA,et al.Increased persistence of lung gene expression using plasmids containing the ubiquitin C or elongation factor 1alpha promoter [J].Gene Ther,2001,8(20):1539-1546.

[11]Laegreid A,Medvedev A,Nonstad U,et al.Tumor necrosis factor receptor p75 mediates cell-specific activation of nuclear factor kappa B and induction of human cytomegalovirus enhancer [J].J Biol Chem,1994,269(10):7785-7791.

[12]Guo ZS,Wang LH,Eisensmith RC,et al.Evaluation of promoter strength for hepatic gene expression in vivo following adenovirus-mediated gene transfer [J].Gene Ther,1996,3(9):802-810.

[13]Loser P,Jennings GS,Strauss M,et al.Reactivation of the previously silenced cytomegalovirus major immediate-early promoter in the mouse liver: involvement of NFkappaB [J].J Virol,1998,72(1):180-190.

[14]Yew NS,Wysokenski DM,Wang KX,et al.Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells [J].Hum Gene Ther,1997,8(5):575-584.