齊 月，金清龍，溫曉玉，?？∑?/p>

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，吉林 長春 130021)

在針對丙型肝炎病毒(HCV)的體外培養(yǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞株HuH-7對于基因型2a型的HCV病毒株JFH1的復(fù)制容許度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于人永生化細(xì)胞株HuS-E/2[1-2]。HuH-7和HuS-E/2基因表達(dá)的對比顯示：HuS-E/2細(xì)胞中存在干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7,IRF7)的固有表達(dá)，而HuH-7細(xì)胞中不具備這種基因的固有表達(dá)[3]。目前對于RNA病毒感染后，尤其是HCV感染后，細(xì)胞內(nèi)部免疫反應(yīng)的研究多使用HuH細(xì)胞株為研究工具，其研究結(jié)果表明：病毒感染后，通過激活I(lǐng)RF3，使其形成二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)IFN 的轉(zhuǎn)錄，IFN 通過干擾素受體(IFNAR)，誘導(dǎo)IRF7的表達(dá)與激活，然后作用于細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)IFN 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終達(dá)到抑制病毒的作用[4-5]。而人原代肝細(xì)胞及永生化肝細(xì)胞中均可以檢測到IRF7的固有表達(dá)[3]，其作用尚不明確?？紤]到固有表達(dá) IRF7在細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用[6]，本文作者擬通過檢測肝細(xì)胞中IRF7在病毒感染后相關(guān)免疫基因[7-12]誘導(dǎo)表達(dá)的作用，以及其對于HCV在HuH-7細(xì)胞中的感染復(fù)制的作用，評估HuH-7是否可以完全替代肝細(xì)胞作為HCV感染體外研究的工具。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)原代肝細(xì)胞凍存液(江陰齊氏)為商業(yè)制品，HuS-E/2細(xì)胞及HuH-7細(xì)胞由北海道大學(xué)Hussein Aly博士饋贈，HuS-E/2和原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)條件為DMEM (Invitrogen)，內(nèi)含44 mmol·L-1碳酸氫鈉、10 mmol·L-1煙堿、5%小牛血清 (Gibco)、5% AB型人血清(Sigma)、20 mmol·L-1HEPES (Gibco)、0.1 mmol·L-1長效抗壞血酸、5 mg·L-1EGF (Sigma)、100 mg·L-1鏈霉素、1%DMSO、8 mg·L-1脯氨酸、0.25 mg·L-1胰島素 (Sigma)、50 nmol·L-1地塞米松、100 IU·mL-1青霉素及2 mg·L-1兩性霉素B。37℃、CO2孵箱培養(yǎng)。HuH-7的培養(yǎng)條件為DMEM (Invitrogen)，內(nèi)含100 IU·mL-1青霉素、10%小牛血清 (Gibco)、20 mmol·L-1HEPES (Gibco)及100 mg·L-1鏈霉素。

1.2 抗體及免疫熒光染抗-IRF7抗體(H246,Santa Cruz Biotechnology),Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG(A11008,Invitrogen)，Alexa Fluor 546 山羊抗人IgG(A11027，Invitrogen)均為商業(yè)制品。以纖維蛋白原Ⅰ包被的玻璃培養(yǎng)板培養(yǎng)HuH-7細(xì)胞，以含有JFH1的培養(yǎng)基孵育過夜進(jìn)行感染，以HCV感染者血清作為第一抗體標(biāo)記HCV感染的細(xì)胞。以纖維蛋白原Ⅰ包被的玻璃培養(yǎng)板培養(yǎng)原代肝細(xì)胞，以仙臺病毒(Sendai virus,SV)感染，在指定時間點，以抗IRF7抗體作為第一抗體進(jìn)行標(biāo)記。采用熒光顯微鏡Biozero進(jìn)行檢測。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染以293T細(xì)胞的全長RNA作為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，克隆全長IRF7的cDNA,并插入pcDNA3表達(dá)載體中，構(gòu)建pcDNA3-IRF7表達(dá)質(zhì)粒。FuGENE transfection reagent(Promega)作為HuH-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，Effectene transfection reagent (Qiagen) 作為原代肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。IRF7顯性負(fù)性突變體表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-7DN為北海道大學(xué)Hussein Aly博士饋贈[3]。psiRNA-hIRF-7(Invitrogen)為商業(yè)制品。

1.4 RNA的提取采用RT-PCR及實時定量PCR(real time PCR)，以氯仿乙醇法提取細(xì)胞全長RNA[2]，以200 ng全長RNA為模板，以one step RNA PCR kit (Takara)進(jìn)行RT-PCR，通過對比特定長度的cDNA條帶灰度，比較其mRNA的表達(dá)水平，以40 ng全長RNA 為模板，以SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems)進(jìn)行實時定量PCR，通過比較mRNA的相對量來比較基因表達(dá)情況。GAPDH 上游引物：5′- CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′，下游引物：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′；IFNα1上游引物：5′-TGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCA-3′，下游引物：5′-TCTGCTCTGACAACCTCAGGCAC-3′；IFNβ上游引物：5′-TTCAGAGGACAGTCGCCACC-3′，下游引物：5′-ATGCCCCAGACCTCCTTCTC-3′；IFNλ3上游引物：5′-GCACACACGAGGCCTATGTC-3′，下游引物：5′-CTTCCACCTGGCCAGGAATC-3′；RIG-I上游引物：5′-GCTCCTACAGGTTGTGGAAA-3′，下游引物：5′-CAGTGGGCCTGAAGATCCTC-3′；IRF7上游引物：5′- TGCTGCCTCGGAACTGTGAC-3′，下游引物：5′- TCACCAGGACCAGGCTCTTC -3′。

2 結(jié) 果

2.1 HuH-7細(xì)胞與肝細(xì)胞在RNA病毒感染后的免疫相關(guān)基因表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果顯示：未經(jīng)感染的HuH-7中無IRF7的表達(dá)，而原代肝細(xì)胞中存在IRF7的固有表達(dá)(圖1)。在感染12 h之內(nèi)，相同RT-PCR檢測條件下，HuH-7細(xì)胞中未檢測到相關(guān)基因RNA的條帶，而原代肝細(xì)胞中檢測到IFNα1、IFNβ、IFNλ3和RIG-I 的誘導(dǎo)表達(dá)。但I(xiàn)FNα1的誘導(dǎo)表達(dá)量很低(圖2)。

圖1 IRF7在未經(jīng)感染的原代肝細(xì)胞和HuH-7細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 永生化肝細(xì)胞在RNA病毒感染后的干擾素誘導(dǎo)在感染早期，表達(dá)7DN的細(xì)胞中，IFNα1、RIG-I、IFNβ和IFNλ3的誘導(dǎo)均受到抑制，但感染6 h后，這種抑制逐漸消退(圖3)。轉(zhuǎn)染psiRNA-hIRF-7 HuS-E/2細(xì)胞中IRF-7的mRNA水平降低至正常水平的20%。實時PCR法檢測，SV感染3 h內(nèi)IFNα1、RIG-I、IFNβ和IFNλ3的表達(dá)情況見圖4，結(jié)果顯示：在永生化肝細(xì)胞被SV感染的前3 h，可以檢測到上述基因的誘導(dǎo)表達(dá)，而在IRF-7 mRNA下調(diào)的細(xì)胞中，上述基因的表達(dá)水平明顯降低。

圖2 SV感染后相關(guān)基因的表達(dá)

圖3 HuS-E/2細(xì)胞中IFNα1、IFNβ、IFNλ3和 RIG-I的表達(dá)

2.3 感染前即存在IRF7異位表達(dá)的HuH-7細(xì)胞中JFH1的感染水平與轉(zhuǎn)染pcDNA3的細(xì)胞比較表達(dá)異位IRF7的HuH-7細(xì)胞中，JFH1的感染率明顯下降(圖5，見封二)。提示IRF7的異位表達(dá)可以抑制HuH-7細(xì)胞中HCV的感染復(fù)制。利用健康者血清作為第一抗體重復(fù)檢測轉(zhuǎn)染空載體的HuH-7細(xì)胞時，IRF7及HCV感染的信號見圖6(封二)。

3 討 論

IRF7參與免疫過程中細(xì)胞干擾素的誘導(dǎo)，機(jī)體的大部分細(xì)胞不存在IRF7的固有表達(dá)，在HCV感染后，通過IFNβ誘導(dǎo)，可以大量產(chǎn)生。但最近有研究報道：人肝細(xì)胞中存在大量固有表達(dá)的IRF7，其功能尚不清楚。本研究通過轉(zhuǎn)染IRF7表達(dá)載體入沒有IRF7固有表達(dá)的HuH-7細(xì)胞，檢測其轉(zhuǎn)染前后HCV的感染支持水平，對比HuH-7細(xì)胞與肝細(xì)胞在SV感染后IFNα1、RIG-I,、IFNβ和IFNλ3的誘導(dǎo)以及抑制IRF7功能，以上述基因的表達(dá)變化來初步闡述IRF7在肝細(xì)胞病毒感染后免疫反應(yīng)中的作用。肝臟是人體最大的實體免疫器官，其生理地位決定了其要面對大量的入侵因素，包括病毒、細(xì)菌等，IRF7的固有表達(dá)，很可能決定了肝臟應(yīng)對各種入侵因素的反應(yīng)程度，有利于機(jī)體的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果從另外一個角度說明目前比較常用的HuH-7細(xì)胞并不能完全真實地反應(yīng)HCV感染肝細(xì)胞的情況，尚需開發(fā)新HCV體外模型，以便更好地進(jìn)行HCV感染的研究。

圖4 實時PCR檢測SV感染3 h內(nèi)HuS-E/2細(xì)胞中RIG-I (A)、IFNα1(B)、IFNλ3(C)和IFNβ(D)的表達(dá)

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