李 偉，吳 剛，薛榮亮

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

在腦缺血再灌注損傷中，程序性細(xì)胞死亡即凋亡是腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元死亡的主要方式，對其機(jī)制的研究是目前的熱點(diǎn)。研究[1]表明：細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2與p53被認(rèn)為是最重要的調(diào)控基因。p53可調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與DNA復(fù)制與損傷修復(fù)，誘導(dǎo)凋亡。所以，p53及其相關(guān)基因的表達(dá)已成為目前腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Bcl-2是凋亡重要調(diào)控基因，目前認(rèn)為，Bcl-2可抑制細(xì)胞凋亡，其家族基因在調(diào)節(jié)線粒體通透性中發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注損傷中Bcl-2對p53表達(dá)有無影響尚未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究利用過度表達(dá)Bcl-2的大鼠，研究其腦缺血再灌注后P53蛋白的表達(dá)，探討B(tài)cl-2的抗凋亡作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(PBS)及Poly-Lysene多聚賴氨酸(北京中山生物制品公司)，P53檢測試劑盒(美國Santa Gruz Biotechnology公司)，原位未端標(biāo)記細(xì)胞凋亡試劑盒(美國 Oncogene試劑公司)，Bcl-2檢測試劑盒(北京中山生物制品公司)。

1.2 動(dòng)物模型的制備及分組雄性健康SD大鼠90只，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量為(300±20) g。隨機(jī)分為3組(n=30)：假手術(shù)組(SO組)、缺血再灌注組(IR組)和Bcl-2過度表達(dá)組(Bcl-2組)。

Bcl-2組模型利用西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院生物技術(shù)室hbcl-2 cDNA克隆載體，設(shè)計(jì)引物序列為： 5′-CTCGAGTATGGCGCAAGCCGGGAG,3′-GCGGCCGCTCACTTGTGGCCCAGG-TATGCACC，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后，與pLNCX2進(jìn)行雙酶切，并用T4DNA連接酶定向連接，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLN-Bcl。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染法將該載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞PT-67，篩選陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)一步培養(yǎng)，收集和濃縮病毒液，最后測定病毒滴度。SD大鼠麻醉固定，參照大鼠立體定位圖譜，在立體定位儀上用10 μL的Hamilton微量注射器向左右側(cè)的海馬回各注射病毒濃縮液5 μL[2]。

IR組及Bcl-2組全腦缺血再灌注動(dòng)物模型采用4-血管法建立，全腦缺血6 min后再灌注。SO組大鼠只暴露血管而不夾閉，其余操作與另兩組相同。麻醉方法采用2%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1行腹腔內(nèi)注射。分別于再灌注后6、12、24、48、72及96 h處死，用4%多聚甲醛200 mL灌注，切取腦組織標(biāo)本，分別在4%多聚甲醛、酒精、二甲苯及石蠟中浸泡后，對標(biāo)本行石蠟包埋。

1.3 P53免疫組織化學(xué)染色P53蛋白多克隆抗體及生物素標(biāo)記羊抗原IgG抗體由Santa Cruz公司提供，對標(biāo)本行免疫組織化學(xué)SP法染色，切片脫蠟后加P53多克隆抗體(兔IgG，滴度均為1∶50)染色。陽性標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核或者細(xì)胞漿染色呈棕黃色或淡黃色，測定灰度值。

1.4 細(xì)胞光鏡觀察術(shù)后6、12、24、48、72及96 h處死大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后HE染色，光鏡下觀察海馬組織學(xué)變化。

1.5 原位末端標(biāo)記法參考李偉等[3]所用方法。石蠟切片經(jīng)蛋白酶消化后，在末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TDT)作用下將生物素標(biāo)記的核苷酸原位摻入DNA缺口，再與辣根過氧化酶標(biāo)記的抗生物素蛋白抗體結(jié)合，顯色。

1.6 灰度值測定結(jié)果判斷P53陽性標(biāo)準(zhǔn)為切片中顯示細(xì)胞漿或細(xì)胞核有明顯的黃色、棕褐色顆?；虬咂瑺?。對P53陽性結(jié)果進(jìn)行半定量測定，所用儀器為德國Leica-Q550E彩色圖文分析計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。

2 結(jié) 果

2.1 腦缺血再灌注后P53蛋白在CA1及CA3區(qū)的表達(dá)及灰度變化全腦缺血再灌注24 h后，IR組CA1區(qū)P53蛋白開始微弱表達(dá)，隨后逐漸升高，于72 h達(dá)高峰，而后下降，主要位于胞核。CA3區(qū)于再灌注后48 h出現(xiàn)P53蛋白的表達(dá)，逐漸增加，于72 h達(dá)高峰后下降；但表達(dá)強(qiáng)度較CA1區(qū)弱，主要位于胞核。見表1。Bcl-2組P53蛋白CA1及CA3區(qū)表達(dá)強(qiáng)度弱于IR組，但其表達(dá)主要位于胞漿。見圖1(封二)。

表1 P53蛋白在海馬回CA1區(qū)和CA3區(qū)表達(dá)的變化

2.2 HE染色結(jié)果SO組中，海馬神經(jīng)細(xì)胞排列有序，光鏡下細(xì)胞核透明清晰、可見1 ～ 2個(gè)明顯的核仁。全腦缺血再灌注6 h后，IR組HE染色改變不明顯；再灌注24 h后，CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞開始出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷性改變；再灌72 h后，神經(jīng)細(xì)胞損傷最嚴(yán)重，光鏡下細(xì)胞數(shù)目降低，核膜不清晰，未見核仁。與CA1區(qū)比較，IR組CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷較輕，Bcl-2組神經(jīng)細(xì)胞損傷較IR組輕微。見圖2(封二)。

2.3 原位末端標(biāo)記法結(jié)果IR組全腦缺血再灌注24～48 h后海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)最多；至再灌注72 h后，海馬CA1區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)開始減少，見表2。與CA1區(qū)比較，IR組CA3區(qū)24 ～ 96 h凋亡細(xì)胞數(shù)較少，見表2。與IR組比較，Bcl-2組凋亡細(xì)胞數(shù)少，見表2及圖3(封二)。

3 討 論

腦缺血再灌注后在神經(jīng)細(xì)胞凋亡區(qū)域蛋白表達(dá)總體上顯著受到抑制，但卻有多種蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子特異性和延遲性表達(dá)，P53即是其中較重要的一種。目前已證實(shí)，P53可介異細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族是目前最受重視的凋亡相關(guān)基因家族。Bcl-2家族既能阻抑壞死又能阻抑凋亡[4]。Bcl-2過度表達(dá)對腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，但其對P53的影響未見報(bào)道。

p53基因是與腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切的凋亡調(diào)控基因之一[5]。本研究利用4-血管法制作大鼠全腦缺血再灌注模型后發(fā)現(xiàn)：P53蛋白在缺血再灌注后24 h表達(dá)，72 h達(dá)到高峰，其表達(dá)時(shí)間與細(xì)胞凋亡時(shí)序相吻合，提示p53基因參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程。海馬神經(jīng)元對缺血十分敏感，常取海馬區(qū)測定P53蛋白[6]。本研究結(jié)果顯示：P53蛋白表達(dá)主要集中在CA1區(qū)，即神經(jīng)元嚴(yán)重受損部位，CA3區(qū)雖有表達(dá)，但程度較CA1區(qū)弱，說明P53蛋白表達(dá)與凋亡分布在相同區(qū)域。本研究證實(shí)了P53參與全腦缺血再灌注后海馬神經(jīng)元的凋亡。腦缺血再灌注可干擾腦的氧供和能量代謝，產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可對DNA造成損傷。DNA受損時(shí)缺血缺氧等刺激可引起細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶PKC和JNK磷酸化而激活p53，使p53在絲氨酸位點(diǎn)磷酸化。p53 mRNA和蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累，并且免疫活性增強(qiáng)，可直接引起凋亡，也可以通過調(diào)節(jié)其他相關(guān)基因引起凋亡，其作用機(jī)制可能是通過影響B(tài)cl/Bax的平衡來調(diào)控凋亡。P53蛋白表達(dá)后，經(jīng)過Bcl-2家族成員的調(diào)節(jié)，使Cyt-c從線粒體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，Cyt-c與凋亡蛋白激活因子(Apaf-l)和前caspase-9形成復(fù)合物，激活caspase-9，引起caspase家族級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡。

表2 各組大鼠海馬回CA1 區(qū)和CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)的變化

Bcl-2基因家族是一種重要的內(nèi)源性抗凋亡因子，對維持腦缺血再灌注后某些神經(jīng)細(xì)胞的生存有重要作用[7]。本研究通過向大鼠海馬內(nèi)注入Bcl-2病毒載體，制成Bcl-2過度表達(dá)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腦缺血再灌注后，CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯減少，說明Bcl-2的過度表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡有抑制作用,與Linnk[8]的研究結(jié)果相符。Bcl-2主要位于線粒體,是一種可以對抗細(xì)胞凋亡發(fā)生的凋亡調(diào)控癌基因,主要分布在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周膜,可以調(diào)節(jié)膜的通透性,其拮抗細(xì)胞凋亡的作用與Bax促凋亡作用相對。Bcl-2可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，抑制caspase-3的激活。研究[9]表明：線粒體膜通透性的增加與促凋亡的Bcl-2家族成員表達(dá)下調(diào)或抗凋亡的家族成員表達(dá)上調(diào)有關(guān),Bcl-2水平的增高可抑制細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)：Bcl-2組中P53的表達(dá)在CA1及CA3區(qū)都減弱，提示Bcl-2過度表達(dá)對P53的表達(dá)產(chǎn)生抑制。Bcl-2抗凋亡可能是通過抑制Bax等促凋亡基因的發(fā)揮。Bax是調(diào)控凋亡的Bcl-2家族的前凋亡成員,Bax已被確認(rèn)為p53直接的早期應(yīng)答基因。推測過度表達(dá)Bcl-2可抑制Bax的表達(dá)，從而抑制P53表達(dá)。本研究中還發(fā)現(xiàn)：P53的表達(dá)主要位于胞漿，胞核較少。Bcl-2可改變P53 CDC2及CDK2細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和核-胞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)，Bcl-2與編碼p53基因的共表達(dá)延緩p53誘導(dǎo)的凋亡，Bcl-2封閉p53進(jìn)入核中，從而阻斷P53誘導(dǎo)的調(diào)亡。這可能是在研究中Bcl-2組P53在海馬表達(dá)主要位于胞漿而胞核較少的原因之一。總之，缺血再灌注可導(dǎo)致P53的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而引發(fā)腦損害，Bcl-2過度表達(dá)可減弱P53的表達(dá)，但是否通過其抑制凋亡有待進(jìn)一步研究。

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