王麗敏,田 寅,楊 玉,盧春鳳,趙錦程,劉明遠(yuǎn)

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

貫葉金絲桃為藤黃科金絲桃屬植物,具有清熱解毒、抗病毒、抗抑郁等功效[1]。貫葉金絲桃富含黃酮類抗腫瘤成分,而目前我國對其抗腫瘤的研究應(yīng)用還不多[2],本實(shí)驗(yàn)選用人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT8作為研究對象,對貫葉金絲桃提取物體外抗腫瘤作用進(jìn)行初步探討,從而為天然藥用植物貫葉金絲桃的開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HCT8細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。貫葉金絲桃提取物由本實(shí)驗(yàn)室制備,用含2%小牛血清 RPM I1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度;四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT)、胰蛋白酶購自美國 Sigma公司;小牛血清、青-鏈霉素雙抗、RPM I1640培養(yǎng)液購自天津?yàn)笊锕?Fax-3200酶標(biāo)儀購自美國Awareness公司;Pas流式細(xì)胞儀購自德國 Partec公司。

1.2 方法

1.2.1 HCT8細(xì)胞的培養(yǎng)

人腫瘤細(xì)胞 HCT8為貼壁生長細(xì)胞,加入含10%小牛血清,100U/mL青-鏈霉素的 RPM I1640培養(yǎng)液 ,置于37℃恒溫、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化、傳代、繁殖細(xì)胞。

1.2.2 M TT法檢測貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞的生長抑制作用

取對數(shù)生長期 HCT8細(xì)胞消化后,配成單細(xì)胞懸液,以每孔2×105個細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,預(yù)培養(yǎng) 24h后,換液,加入不同濃度的貫葉金絲桃提取物(6.25μg/mL,12.5 μg/mL,25 μg/mL,50 μg/mL,100μ g/mL,200 μg/mL),同時設(shè)終濃度為 10μg/mL的 5-Fu陽性對照組、陰性對照組及空白對照組。加藥后再分別培養(yǎng)24h、48h、72h,每孔加入5mg/mL的 M TT溶液10μL,繼續(xù)孵育4h。小心吸棄培養(yǎng)液,每孔加入100 μLDM SO,振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上于490nm波長處測定各孔光吸收值(OD值),計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=(對照孔 OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對照孔 OD值×100%。

1.2.3 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期 HCT8細(xì)胞,按 5×105個 /孔接種于24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板,預(yù)培養(yǎng) 24h。設(shè)置3個藥物作用濃度,分別為12.5 μg/mL,25 μg/mL,50μ g/mL,同時做陰性對照孔 (加細(xì)胞和培養(yǎng)液,不加藥物)。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h。利用 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑及流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡百分率檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間顯著性差異采用t檢驗(yàn) ,以 P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 M TT比色實(shí)驗(yàn)

從表1結(jié)果可知,貫葉金絲桃提取物體外可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT8的增殖,在6.25～200μ g/mL的范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時間依賴性。隨著劑量的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng),而且隨著時間的延長,抑制作用變化明顯。表明貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制作用。

表1 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞生長抑制率(%)的影響 (±s,n=6)

表1 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞生長抑制率(%)的影響 (±s,n=6)

注:與5-FU對照組比較,*P＞ 0.05。

組 別 劑量 (μ g/mL) 24h 48h 72h貫葉金絲桃提取物 6.25 10.24±0.79 12.63±0.65 21.21±1.3512.5 20.37±1.48 23.87±1.08 39.85±2.0925 25.29±1.61 36.12±2.23 49.76±3.0350 31.95±2.17 57.31±3.38 79.23±2.26100 37.02±2.65 65.06±2.47 82.62±3.01*200 48.03±2.98 76.18±3.64 83.77±4.17*5-FU 10 50.83±3.59 77.33±4.09 80.36±3.99

表2 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞凋亡率 (%)的影響 (±s,n=6)

表2 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞凋亡率 (%)的影響 (±s,n=6)

注:與對照組比較,*P＜0.05,** P＜0.01。

組 別 劑量 (μ g/mL) 24h 48h 72h對照組 - 0.85±0.03 3.96±0.84 6.75±1.01貫葉金絲桃提取物 12.5 13.21±1.37* 23.13±1.95* 37.08±1.98**25 19.33±1.15* 38.46±2.28** 48.19±2.01**50 25.42±2.25* 49.87±3.49** 59.13±3.76**

2.2 貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞凋亡率的影響

從表2結(jié)果可知,貫葉金絲桃提取物處理 HCT8細(xì)胞后,會引起細(xì)胞凋亡百分率的提高,當(dāng)濃度為50 μg/mL作用72h時,凋亡百分率達(dá)到(59.13±3.76)%。

3 討論

腫瘤借助腫瘤細(xì)胞的分裂增殖而不斷地生長發(fā)展?？鼓[瘤藥可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖來阻斷其侵襲發(fā)展[3]。本實(shí)驗(yàn)采用 M T T法檢測貫葉金絲桃提取物對 HCT8細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明,貫葉金絲桃提取物在一定劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[4]。細(xì)胞凋亡與腫瘤的進(jìn)展與退化關(guān)系密切,可被藥物與理化因素促發(fā)[5]。凋亡已成為抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)顯示 HCT8結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)過貫葉金絲桃提取物處理后,在流式細(xì)胞儀上檢測到細(xì)胞凋亡百分率的提高,證明了貫葉金絲桃提取物對 HCT8腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。關(guān)于其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1]Josey E S,Tackett R L St.John’s wort:a new alternative for depression[J].International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics,1999,37(3):111-113

[2]李艷,曹學(xué)麗,付 鵬.貫葉金絲桃活性成分及其分離純化與檢測方法的研究進(jìn)展 [J].藥學(xué)進(jìn)展,2008,32(1):15-17

[3]Sleller H.M echanisms and genes of cellular suicide[J].Science,1995,267(10):1445-1449

[4]王麗敏,江清林,畢士有,等.金絲桃甘對體外腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用研究 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2010,33(1):73-74

[5]Johnstone RW,Ruefli AA,Lowe SW.Apoptosis:a link between cancer genetics and chemotherapy[J].Cell,2002,108(7):153-157