董海燕，施點望，衛(wèi) 敏

(福建省纖維檢驗局，福建 福州，350026)

沙門氏菌是屬腸桿菌科的重要病原菌屬，有史以來，沙門氏菌都是食品行業(yè)的重要檢測指標。而對于紡織行業(yè)，沙門氏菌是羽絨及其羽絨制品的必檢指標[1]，檢測周期很長，一般為5～7d[2-3]，過程相當繁瑣，尤其是過濾過程，相當耗時，難以適應市場檢驗中快速、簡便、精準的要求。因此尋求一種較為實際的快速檢測方法具有重要現(xiàn)實意義和理論價值，值得研究。

Py-GC-MS技術具有簡便、快速、靈敏和可重復性強等優(yōu)點，它已日益廣泛地應用于檢出和鑒別微生物[4-5]。本研究利用Py-GC-MS技術對沙門氏菌全細胞進行了條件分析，確定了適合進行沙門氏菌的Py-GC-MS的條件以及部分裂解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，從而為快速鑒定沙門氏菌提供一種新方法，縮短羽絨中沙門氏菌的檢測周期，為羽絨檢測標準的實施和修正提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

甲型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi A），菌株編號：CMCC（B）50093，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：10072104B。

1.2 試驗試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；37%甲醛溶液（福爾馬林）為分析純；無菌水，本試驗室自制。

1.3 儀器設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；PY-2020is熱裂解儀，安捷倫；G1888-7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；KA-1000臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜，蘇州凈化設備有限公司；ZHWY-100B型恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；VDRTEX-5混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.4 菌體制備

1.4.1 接種菌液和培養(yǎng)

用1mL營養(yǎng)肉湯，將凍干粉菌種制成菌液。然后取0.1mL菌液接種至10mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)箱中，100轉(zhuǎn)/min，振蕩培養(yǎng)24h。再取1mL菌液接入100mL營養(yǎng)肉湯中，繼續(xù)置37℃培養(yǎng)箱中，100轉(zhuǎn)/min，振蕩培養(yǎng)24h。

1.4.2 滅活和收集

將1mL的37%甲醛溶液加入到100mL的培養(yǎng)液中將其滅活。滅活后的培養(yǎng)液，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/min離心數(shù)次后，收集菌體，用無菌蒸餾水洗滌2次后，再加入0.1mL的無菌水，旋渦振蕩后分裝至樣瓶。

1.4.3 預冷和凍干

將分裝好的菌體，置于-20℃冰箱，冷凍24h后，置于冷凍干燥機中，冷凍干燥成粉狀后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熱裂解氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 裂解條件

裂解溫度650℃，時間為12s，表面溫度280℃，進樣量：0.2mg。

1.5.2 氣相色譜條件

色譜柱（DB-17MS，30m×0.25mm）；升溫程序：起始溫度44℃（2min），采用5℃/min的速率上升至200℃（8min），然后300℃后運行2min；分流比為1：50；載氣為氦氣。

1.5.3 質(zhì)譜條件

離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，電離方式EI，電離電壓為69eV，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫為安捷倫公司數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌熱裂解氣相色譜圖

沙門氏菌全細胞經(jīng)650℃熱裂解，裂解產(chǎn)物為多種低分子質(zhì)量物質(zhì)，在優(yōu)化后的氣相色譜-質(zhì)譜條件下，可得到清晰的總離子流色譜圖，并對主要熱裂解產(chǎn)物對應的色譜峰進行了數(shù)字標識，色譜峰號分別是：1#-10#，如圖1所示。

2.2 沙門氏菌熱裂解產(chǎn)物分析

沙門氏菌全細胞在650℃裂解時，裂解產(chǎn)物經(jīng)氣相色譜分離后，再由質(zhì)譜系統(tǒng)進行分析，譜圖經(jīng)儀器自帶譜庫檢索，由人工解析，對主要的10種裂解產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：熱裂解產(chǎn)物分為四大類，其中，第一類：脂肪族裂解產(chǎn)物，主要以二氧化碳為代表，該類物質(zhì)是沙門氏菌全細胞高度裂解的產(chǎn)物，其產(chǎn)率最高；第二類：芳香族裂解產(chǎn)物，以甲苯、苯酚、對甲苯酚、苯乙腈等為代表，該類物質(zhì)的主要特征是含有苯環(huán)；第三類：烯類裂解產(chǎn)物，其代表物質(zhì)是1-十三烯；第四類：雜環(huán)類裂解產(chǎn)物，其代表物質(zhì)是：腺嘌呤、2-呋喃甲醇。

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2.3 沙門氏菌熱裂解產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)分析

沙門氏菌全細胞經(jīng)熱裂解后，10種主要產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)式及其對應的CAS#如表2所示。經(jīng)理論分析，沙門氏菌屬腸科細菌，是一類單細胞物質(zhì)，其構(gòu)架組成主要為肽聚糖（由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替相連而形成的多糖鏈）、脂類、蛋白質(zhì)（由氨基酸組成）、DNA（脫氧核糖核酸，組成單位是核苷酸，而糖類與磷酸分子由酯鍵相連，組成其長鏈骨架）和RNA（核糖核酸，由核苷酸單元長鏈組成，每個單元含有一個含氮堿基、一個核糖苷和一個磷酸基）[6-7]。經(jīng)分析沙門氏菌全細胞組成物質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)和表2中沙門氏菌熱裂解產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：裂解產(chǎn)物一部分是由于高溫而產(chǎn)生的炭化產(chǎn)物（比如：二氧化碳），一部分是由于高溫造成分子之間連接鍵的斷裂而形成的單一結(jié)構(gòu)（比如：嘌呤、吲哚等物質(zhì)）。

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2.4 沙門氏菌部分熱裂解產(chǎn)物質(zhì)譜分析

沙門氏菌全細胞經(jīng)650℃熱裂解，形成的裂解產(chǎn)物經(jīng)色譜分離后，用質(zhì)譜系統(tǒng)進行分析。根據(jù)裂解產(chǎn)物的離子碎片信息，經(jīng)安捷倫化學物質(zhì)譜庫檢索進行定性鑒定，確認了大部分裂解產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)，其匹配度較高；但由于匹配度較低而存在小部分裂解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)無法確定。其中圖1中2#峰上的2個質(zhì)譜圖如圖2和圖3所示；圖1中10#峰上的2個質(zhì)譜圖如圖4和圖5所示。結(jié)果表明：2#對應的2個質(zhì)譜圖的m/z極其一致；且10#峰對應的質(zhì)譜圖m/z也極其一致，這說明圖1總離子流色譜圖中的峰純度很高。

圖2 圖1中2#峰對應的質(zhì)譜圖1

圖3 圖1中2#峰對應的質(zhì)譜圖2

圖4 圖1中10#峰對應的質(zhì)譜圖1

圖5 圖1中10#峰對應的質(zhì)譜圖2

3 結(jié)論

本文通過相關試驗，得到以下幾點結(jié)論：

1、沙門氏菌全細胞在裂解溫度650℃，裂解時間為12s，在起始溫度44℃（2min），采用5℃/min的速率上升至200℃（8min）的氣相分離后，在離子源溫度230℃的條件下可得到清晰的總離子流色譜圖。

2、沙門氏菌全細胞熱裂解產(chǎn)物的總離子色譜圖中的色譜峰純度很高。

3、沙門氏菌全細胞的熱裂解產(chǎn)物主要有四類，分別是：脂肪族類，其代表是：二氧化碳；芳香族類，其代表是：甲苯、苯乙腈等；烯類，其代表是：1-十三烯；雜環(huán)類，其代表是：腺嘌呤。

4、沙門氏菌全細胞的10種裂解產(chǎn)物的化學結(jié)構(gòu)得到鑒定，經(jīng)與細胞組成物質(zhì)結(jié)構(gòu)相比得知這些裂解產(chǎn)物除二氧化碳之外，主要是由于分子之間的鏈接鍵斷裂而形成的。

[1]FZ/T 81002—002 水洗羽毛羽絨[S].

[2]FZ/T 80001—002 水洗羽毛羽絨試驗方法[S].

[3]GB/T 10288—003 羽絨羽毛檢驗方法檢驗方法[S].

[4]郭愛玲，郭華英，馬愛民，等.沙門氏菌全細胞的熱裂解氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].分析化學，2007，35（5）: 700-702.

[5]紀標，仁培上，唐銀，等.傷寒沙門氏菌的裂解氣相色譜分析[J].微生物學報，1992，19（6）: 344-348.

[6]翟中和，王喜中，丁明孝.細胞生物學[M].高等教育出版社，2000，302-305.

[7]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M].高等教育出版社，1989，51-55.