孫運良，徐 燦，蘇長青，馬建霞，吳紅玉

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海210043；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院分子腫瘤研究室，上海210043）

熱休克蛋白質(zhì)70（heat shock protein 70，Hsp70）是一類廣泛存在于各種生物體內(nèi)的進化上高度保守的細胞應(yīng)激蛋白。研究已證實，腫瘤細胞來源的Hsp70不僅可作為抗原提呈的輔助分子參與腫瘤抗原肽的加工和處理，增強腫瘤抗原的穩(wěn)定性和免疫原性，而且可作為抗原呈遞分子直接將腫瘤抗原肽遞呈給T細胞，特別是細胞毒性T細胞，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強大的抗腫瘤免疫效應(yīng)［1－3］。近年來，以Hsp70為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注，本研究利用前期構(gòu)建的表達Hsp70基因的重組腺病毒治療胰腺癌荷瘤小鼠動物模型，觀察該重組腺病毒對荷瘤小鼠移植瘤生長的抑制作用及其對免疫功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細胞株BxPC－3為長海醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室保存，BxPC－3細胞在含10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各10 U／mL。表達Hsp70基因的重組腺病毒Ad5－pCEA－Hsp70以及對照病毒Ad5－control為本研究前期所構(gòu)建［4］。小鼠抗人Hsp70單克隆抗體購自Stressgen公司；FITC標記的抗小鼠CD4、CD8單克隆抗體為eBioscience公司產(chǎn)品；IL－2、INF－γ、IL－4、IL－10ELISA檢測試劑盒購自BD公司，清潔級健康雄性的C57BL／6小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，6～8周齡，購于上海中科院斯萊克動物中心，第二軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 胰腺癌荷瘤小鼠動物模型的建立 常規(guī)培養(yǎng)BxPC－3細胞，收集處于對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度，將總量為5×106的細胞接種于C57BL／6小鼠腹部皮下。每周兩次觀察荷瘤小鼠皮下瘤的生長情況，以游標卡尺測量瘤體的長徑和短徑，通過a×b2／2（a為長徑，b為短徑）計算移植瘤的大?。?］。

1.2.2 實驗分組及處理 待小鼠皮下形成直徑約0.5cm的移植瘤后，隨機將小鼠分為荷瘤組、對照組和治療組，每組共8只動物。其中荷瘤組不作任何治療；對照組給予腹腔注射溶于100μL PBS的對照病毒2×108PFU，每隔1d1次，共注射5次；治療組給予腹腔注射溶于100μL PBS的重組腺病毒2×108PFU，每隔1d1次，共注射5次。

1.2.3 抑瘤效果和抑瘤率的評價 每周兩次觀察荷瘤小鼠的皮下瘤的生長情況，繪制腫瘤生長曲線，評價抑瘤效果。當(dāng)荷瘤組腫瘤體積長至約1 000mm3時，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉各組實驗動物，通過摘除眼球取血后處死動物，剝離皮下移植瘤，電子天平稱質(zhì)量，計算腫瘤抑制率。抑瘤率＝［（荷瘤組平均瘤質(zhì)量－治療組平均瘤質(zhì)量）／荷瘤組平均瘤質(zhì)量］×100%。

1.2.4 Western blot檢測移植瘤組織Hsp70蛋白表達 用RIPA裂解液制備移植瘤組織蛋白，蛋白分析系統(tǒng)（Bio－Rad）測定蛋白濃度，上樣于20%SDS－PAGE電泳，電轉(zhuǎn)染到硝酸纖維膜。室溫下用含5%脫脂奶粉的1×PBS封膜2h。加入Hsp70單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗，室溫孵育2h，ECL顯影。結(jié)果用凝膠圖像軟件分析系統(tǒng)對膠片掃描，與內(nèi)參照β－actin進行比較，計算其比值。

1.2.5 脾指數(shù)測定 摘取小鼠的脾臟，用濾紙吸干殘血后，電子天平稱質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)＝［脾臟質(zhì)量（mg）／小鼠體質(zhì)量（g）］×100%。

1.2.6 流式細胞儀檢測脾單核細胞中CD4＋、CD8＋細胞比例 分離小鼠脾臟，制備單細胞懸液，經(jīng)FITC標記的抗小鼠CD4、CD8單克隆抗體標記后，通過流式細胞儀檢測CD4＋、CD8＋細胞比例。

1.2.7 ELISA測定外周血中細胞因子的含量 取各組實驗動物的外周血，離心后收集血清，按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測細胞因子IL－2、INF－γ、IL－4、IL－10的含量。

1.2.8 酶法檢測各組動物肝、腎功能 采用酶法通過HITACHI－7150型自動生化分析儀測定各組動物血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）以及肌酐（Cr）含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒對荷瘤小鼠皮下移植瘤的生長抑制作用C57BL／6小鼠皮下接種BxPC－3細胞后，5～7d后可以看見并能觸及瘤結(jié)節(jié)，成瘤率100%。荷瘤組和對照組瘤體生長迅速，兩組之間各個時間點腫瘤體積均差異無統(tǒng)計學(xué)意義；治療組腫瘤生長則受到明顯抑制，與荷瘤組和對照組各個時間點腫瘤體積相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。實驗終止時，治療組的腫瘤質(zhì)量為（0.62±0.18）g，顯著低于荷瘤組和對照組［（1.32±0.27）g，（1.27±0.29）g；P＜0.01］；治療組的腫瘤抑制率為53.1%，而對照組的腫瘤抑制率為3.79%。

2.2 重組腺病毒對荷瘤小鼠皮下移植瘤Hsp70蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示（圖2），重組腺病毒能夠較好的介導(dǎo)Hsp70蛋白在荷瘤小鼠皮下移植瘤表達，治療組Hsp70蛋白相對表達量為0.97±0.18，顯著高于對照組與荷瘤組（0.31±0.09，0.27±0.07；P＜0.01）。

圖1 重組腺病毒對胰腺癌荷瘤小鼠皮下移植瘤生長的影響

圖2 Western blot檢測Hsp70蛋白表達

2.3 重組腺病毒對荷瘤小鼠脾指數(shù)和CD4＋、CD8＋細胞比例的影響 治療組脾指數(shù)為12.4±2.6，顯著高于荷瘤組和對照組（P＜0.05）。治療組脾單核細胞CD4＋、CD8＋細胞比例分別為（17.3±2.5）%和（20.5±3.2）%，與荷瘤組和對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 重組腺病毒對荷瘤小鼠脾指數(shù)和CD4＋、CD8＋細胞比例的影響（±s）

表1 重組腺病毒對荷瘤小鼠脾指數(shù)和CD4＋、CD8＋細胞比例的影響（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與荷瘤組相比；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n 脾指數(shù) CD4＋（%） CD8＋（%）8 9.61±1.8 11.8±2.8 9.8±2.1對照組 8 10.50±2.1 12.1±2.6 10.9±1.9治療組 8 12.40±2.6ac 17.3±2.5bd 20.5±3.2荷瘤組bd

2.4 重組腺病毒對荷瘤小鼠血清Th1／Th2細胞因子水平的影響 經(jīng)重組腺病毒治療后，與荷瘤組和對照組相比，治療組血清中細胞因子IL－2、INF－γ含量明顯增加（P＜0.01），IL－10含量則明顯減少（P＜0.01），而IL－4含量無明顯變化，見圖3。

圖3 重組腺病毒對荷瘤小鼠血清Th1／Th2細胞因子水平的影響

2.5 重組腺病毒對荷瘤小鼠肝、腎功能的影響 與荷瘤組和對照組相比，經(jīng)重組腺病毒治療后，各組小鼠之間的肝、腎功能指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 重組腺病毒對荷瘤小鼠肝腎功能的影響（±s）

表2 重組腺病毒對荷瘤小鼠肝腎功能的影響（±s）

組別 n ALT（U／L） AST（U／L） BUN（mmol／L）Cr（μmol／L）8 21.4±3.2 59.4±7.2 4.3±1.5 45.9±7.7對照組 8 22.5±3.5 61.5±5.9 4.8±1.7 47.3±6.9治療組荷瘤組8 23.0±2.8 63.7±7.5 5.5±2.2 46.2±6.3

3 討 論

近年來，隨著分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，免疫基因治療已成為胰腺癌綜合治療的研究方向一。由于Hsp70能同時激活機體特異性免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，因此以Hsp70為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗受到了學(xué)者的廣泛關(guān)注［6－9］。近年來，隨著DNA重組技術(shù)的應(yīng)用和對Hsp70基因的深入研究，使人類可在基因水平構(gòu)建以Hsp70為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗成為現(xiàn)實，促進了Hsp70腫瘤疫苗進行廣泛應(yīng)用的可能性。本研究利用前期構(gòu)建的表達Hsp70基因的重組腺病毒治療胰腺癌荷瘤小鼠，結(jié)果顯示，治療組的腫瘤生長受到明顯抑制，且對肝、腎功能無明顯影響，表明本研究所構(gòu)建的重組腺病毒是一種較好的治療胰腺癌的腫瘤疫苗。

目前關(guān)于Hsp70誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)的確切機制尚未完全明確，多數(shù)研究認為，Hsp70可與腫瘤細胞內(nèi)的抗原多肽結(jié)合，進而通過與抗原遞呈細胞相作用，激活特異性的免疫應(yīng)答。Hsp70可與抗原遞呈細胞表面的特異性高親和受體相結(jié)合，介導(dǎo)抗原肽進入抗原提呈細胞，然后抗原肽與細胞內(nèi)MHC分子形成復(fù)合物，并在抗原提呈細胞表面呈現(xiàn)，通過該復(fù)合物所遞呈的抗原激活特異的免疫應(yīng)答，活化CD4＋和CD8＋T細胞，特別是細胞毒性殺傷細胞，激發(fā)抗腫瘤細胞特異性反應(yīng)［10－11］。本研究也顯示，經(jīng)重組腺病毒治療后，荷瘤小鼠脾指數(shù)以及脾單核細胞中CD4＋、CD8＋細胞比例均明顯增加，證實Hsp70在誘導(dǎo)機體特異性的抗腫瘤免疫中具有重要的作用。

Th細胞根據(jù)功能和產(chǎn)生細胞因子的不同可分為Th1和Th2兩大類，其中Th1細胞產(chǎn)生IFN－γ、TNF－β和IL－2，參與細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)；而 Th2細胞產(chǎn)生IL－4、IL－5、IL－10和IL－13，參與體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。機體的抗腫瘤效應(yīng)，主要依靠Th1類細胞因子的作用。腫瘤患者體內(nèi)Th2類細胞因子多處于優(yōu)勢狀，易產(chǎn)生免疫耐受，成為腫瘤逃避免疫攻擊的機制之一。因此，Th1／Th2類型細胞因子之間的漂移對腫瘤免疫具有重要的影響［12－14］。本研究發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒介導(dǎo)的Hsp70表達，可增加荷瘤小鼠體內(nèi)Th1類細胞因子IL－2、IFN－γ的含量，降低Th2類細胞因子IL－10的水平，從而抑制荷瘤小鼠皮下移植瘤的生長。Chen等［15］研究也發(fā)現(xiàn)，熱處理腫瘤細胞后所產(chǎn)生的Hsp70，可促進巨噬細胞以及樹突狀細胞趨化至腫瘤細胞，并可刺激IL－2、IFN－γ、TNF－α等細胞因子的分泌，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)以腺病毒介導(dǎo)Hsp70表達可對胰腺癌荷瘤小鼠皮下移植瘤的生長具有明確的抑制作用，其機制與增加CD4＋、CD8＋細胞比例，促進IL－2、IFN－γ并抑制IL－10的分泌有關(guān)。但關(guān)于Hsp70誘導(dǎo)機體抗腫瘤免疫的確切機制尚有待于進一步明確；很多宿主體內(nèi)存在抗腺病毒抗體，可以中和或清除腺病毒，降低療效。如何進一步解決上述問題，提高該重組腺病毒治療胰腺癌的療效和安全性，將是今后研究的主要方向。

［1］ Ueda G，Tamura Y，Hirai I，et al.Tumor－derived heat shock protein 70－pulsed dendritic cells elicit tumor－specific cytotoxic T lymphocytes（CTLs）and tumor immunity［J］.Cancer Sci，2004，95（3）：248－253.

［2］ Chan T，Chen Z，Hao S，et al.Enhanced T－cell immunity induced by dendritic cells with phagocytosis of heat shock protein 70gene－transfected tumor cells in early phase of apoptosis［J］.Cancer Gene Ther，2007，14（4）：409－420.

［3］ Figueiredo C，Wittmann M，Wang D，et al.Heat shock protein 70（HSP70）induces cytotoxicity of T－h(huán)elper cells［J］.Blood，2009，113（13）：3008－3016.

［4］ 孫運良，徐燦，蘇長青，等.CEA啟動子驅(qū)動下表達Hsp70基因的重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定［J］.中華胰腺病雜志，2011，11（8）：251－254.

［5］ Liu Y，Ye T，Sun D，et al.Tumor－specific therapeutic effect induced by an oncolytic adenoviral vector containing heat shock protein 70and prodrug activation genes［J］.Gene T－h(huán)er，2006，13（16）：1235－1243.

［6］ Bolhassani A and Rafat S.Heat－shock proteins as powerful weapons in vaccine development［J］.Expert Rev Vaccines，2008，7（8）：1185－1199.

［7］ Ren Z，Ye X，F(xiàn)ang C，et al.Intratumor injection of oncolytic adenovirus expressing HSP70prolonged survival in melanoma B16bearing mice by enhanced immune response［J］.Cancer Biol Ther，2008，7（2）：191－195.

［8］ Li JL，Liu HL，Zhang XR，et al.A phase I trial of intratumoral administration of recombinant oncolytic adenovirus overexpressing HSP70in advanced solid tumor patients［J］.Gene Ther，2009，16（3）：376－382.

［9］ Di Paolo NC，Tuve S，Ni S，et al.Effect of adenovirus－mediated heat shock protein expression and oncolysis in combination with low－dose cyclophosphamide treatment on antitumor immune responses［J］.Cancer Res，2006，66（2）：960－969.

［10］Mambula SS，Calderwood SK.Heat shock protein 70is secreted from tumor cells by a nonclassical pathway involving lysosomal endosomes［J］.J Immunol，2006，177（11）：7849－7857.

［11］Harmala LE，Ingulli EG，Curtsinger JM，et al.The adjuvant effects of mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70result from the rapid and prolonged activation of antigen－specific CD8＋T cells in vivo［J］.J Immunol，2002，169（10）：5622－5629.

［12］AgauguéS，Carosella ED，Rouas－Freiss N.Role of HLA－G in tumor escape through expansion of myeloid－derived suppressor cells and cytokinic balance in favor of Th2versus Th1／Th17［J］.Blood，2011，117（26）：7021－7031.

［13］Godin－Ethier J，Pelletier S，Hanafi LA，et al.Human activated T lymphocytes modulate IDO expression in tumors through Th1／Th2balance［J］.J Immunol，2009，183（12）：7752－7760.

［14］Tosolini M，Kirilovsky A，Mlecnik B，et al Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells（Th1，th2，treg，th17）in patients with colorectal cancer［J］.Cancer Res，2011，71（4）：1263－1271.

［15］Chen T，Guo J，Han C，et al.Heat shock protein 70，re－leased from heat－stressed tumor cells，initiates antitumor immunity by inducing tumor cell chemokine production and activating dendritic cells via TLR4pathway［J］.J Immunol，2009，182（3）：1449－1459.