郭潤(rùn)生，史佩東，陳躍宇

0 引 言

膽囊癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占消化道腫瘤第5位。膽囊癌早期常無(wú)特殊癥狀，進(jìn)展迅速，誤診率高，手術(shù)切除率低，術(shù)后5年生存率低于5%［1］。為了提高患者的生存率，應(yīng)早期診斷膽囊癌、早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶及提供多樣的更為有效的治療手段。生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SS)是一種生長(zhǎng)激素釋放抑制激素，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面SSTR而起作用。SSTR是由7個(gè)特異性跨膜片段組成一個(gè)多肽鏈構(gòu)成的G蛋白受體家族，SSTR表達(dá)于多種人類原發(fā)性腫瘤［2－3］。本文應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)SSTR蛋白在原發(fā)性膽囊癌及正常膽囊組織中的表達(dá)，以期為膽囊癌的診斷治療提供有利的幫助。

1 資料與方法

1.1 病例資料 收集上海嘉定區(qū)中心醫(yī)院及上海新華醫(yī)院普外科2000年1月至2011年10月住院手術(shù)治療的膽囊癌患者29例，有完整的臨床病理學(xué)資料，術(shù)前均無(wú)放療、化療和激素治療。組織學(xué)類型均為腺癌。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。具體資料見(jiàn)表1。另收集25例正常膽囊組織(膽囊炎、膽囊結(jié)石患者)，對(duì)29例膽囊癌組織和25例正常膽囊組織進(jìn)行免疫組化染色。

表1 腫瘤標(biāo)本臨床資料Table 1 Clinical data on the tumor specimens

1.2 儀器及試劑 德國(guó)Leica切片機(jī)及顯微鏡，400倍普通光學(xué)顯微鏡及德國(guó)萊卡生產(chǎn)的DMRQ55O病理圖像分析儀，普通電冰箱、普通高壓鍋、烤箱、玻片，孵育盒，免疫組化筆，青島醫(yī)療儀器一廠的恒溫箱。實(shí)驗(yàn)用SSTR1－3多克隆抗體(兔抗人IgG)購(gòu)自上海博士德公司，SSTR4－5多克隆抗體(兔抗人IgG)購(gòu)自上海晶美公司，SP試劑盒為通用型，二抗為羊抗兔IgG，其中試劑A:封閉用山羊血清工作液，試劑B:生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，試劑C:辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素工作液;0.01 mol PBS(PH=7.4)清洗液;檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液，3%過(guò)氧化氫溶液;4%甲醛溶液固定;DAB顯色試劑盒。實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 操作方法 組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋;以切片機(jī)制成4 μm厚切片;二甲苯脫臘20 min，3 次;梯度酒精水化:100%－100%－95%－95%－75%各5min;3%H2O2孵育5min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;蒸餾水洗 5 min;SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5進(jìn)行抗原修復(fù);SSTR1無(wú)需修復(fù);切片置于盛有EDTA修復(fù)液中，微波10 min，取出后靜置冷卻20 min。修復(fù)液配置:0.5 mol/L Tris－HCl 20 ml，0.5 mol/L EDTA PH 8.02ml，加800ml蒸餾水，混均，用 NaOH調(diào)節(jié)至 PH7.8～8.0，再用蒸餾水補(bǔ)至1000 ml;取出切片，TBS沖洗2～3次，將標(biāo)本周?chē)木彌_液檫干;滴牛血清白蛋白10～15 min，降低背景，封閉非特異性的結(jié)合;加一抗，室溫孵育 1.5～2 h;SSTR1，SSTR2 及 SSTR31∶100，SSTR4 及 SSTR51∶2500;二抗孵育:TBS緩沖液沖洗切片2～3次，滴加二抗室溫30 min;TBS緩沖液沖洗切片2～3次;DAB顯色:取1 ml蒸餾水，加50 μl溶液A，混均，再加溶液B50 μl，混均，室溫下孵育2～10 min，顯微鏡觀察顯色情況，顯色好即用流水沖洗終止反應(yīng);后處理:蘇木精襯染細(xì)A，細(xì)胞核，鹽酸酒精分化脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 染色結(jié)果判定 光鏡下觀察，在良好組織結(jié)構(gòu)和清晰的背景上，免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒。每例隨機(jī)觀察具有代表性的5個(gè)高倍鏡(×200)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分。陽(yáng)性染色位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，強(qiáng)度分為3級(jí):未染色為0分(陰性)、淡黃色為1分(弱陽(yáng)性)、黃色為2分(陽(yáng)性)、棕褐色為3分(強(qiáng)陽(yáng)性);陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。最后兩者得分相乘，0～1分判為陰性，≥2判為陽(yáng)性(2～3分為弱陽(yáng)性，4～5分為陽(yáng)性，≥6分為強(qiáng)陽(yáng)性)。免疫組化結(jié)果由2位病理科醫(yī)師確認(rèn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用Fisher精確概率檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

5種SSTR亞型陽(yáng)性表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，見(jiàn)圖1，呈棕黃色顆粒狀，SSTR在膽囊癌組織中的表達(dá):SSTR1(62.1%)，SSTR2(13.8%)，SSTR3(82.6%)，SSTR4(24.1%)，SSTR5(69%);正常膽囊黏膜中的表達(dá):SSTR1(44%)，SSTR2(12%)，SSTR3(64%)，SSTR4(16%)，SSTR5(24%)。從以上數(shù)據(jù)中可以看出SSTR3在2組SSTR中的表達(dá)均為最高，在正常膽囊組織中的SSTR1的表達(dá)高于SSTR5，而在膽囊癌組織中的表達(dá)與此相反。在以上2種組織中SSTR2的表達(dá)均是最低的。SSTR5表達(dá)在膽囊癌組織比在正常膽囊組織黏膜明顯增加(P=0.045)，其余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2，表3。

表2 SSTR在膽囊癌中的表達(dá)情況［n(%)］Table 2 Expressions of SSTR subtypes in gallbladder cancer n(%)

表3 SSTR在正常膽囊組織(膽囊炎及膽囊結(jié)石)中的表達(dá)情況［n(%)］Table 3 Expressions of SSTR subtypes in the non-cancerous gallbladder tissue(cholecystitis and cystic calculous)n(%)

圖1 SSTR在膽囊癌組織中的表達(dá)Figure 1 Expressions of SSTR subtypes in the cancerous gallbladder tissue

3 討 論

生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SST)是一種環(huán)狀的多肽類激素，最初是從下丘腦分離出來(lái)的，因?yàn)槟芤种拼贵w釋放生長(zhǎng)激素而得名，廣泛存在于人體的內(nèi)分泌和外分泌系統(tǒng)中，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。SST存在2種分子形式，即14肽生長(zhǎng)抑素(SS－14)和28肽生長(zhǎng)抑素(SS－28)，這2種形式不僅結(jié)構(gòu)相似，其生物學(xué)活性也相似，主要表現(xiàn)為可抑制多種內(nèi)分泌、外分泌細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)膽道和胃腸道的運(yùn)動(dòng)，以及可作為神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)大腦的運(yùn)動(dòng)和識(shí)別功能。另外，SST 還可廣泛地抑制細(xì)胞增殖活性［4－5］。研究發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑素具有抑制膽囊癌細(xì)胞株GBC－SD的增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用［6－7］。近年來(lái)，SST 抗腫瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)及人工合成的生長(zhǎng)抑素類似物(somatostatin analogue，SSTA)的臨床應(yīng)用，受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。

生長(zhǎng)抑素及其類似物多種生物學(xué)活性的發(fā)揮是通過(guò)靶細(xì)胞膜上的特異性受體即SSTR介導(dǎo)的［8］。目前已發(fā)現(xiàn)5種SSTR亞型，分別命各為SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4和SSTR5。長(zhǎng)效生長(zhǎng)抑素主要通過(guò)與SSTR2、3和5結(jié)合而發(fā)揮作用。不同配體與不同亞型受體的親和力不同，不同亞型受體介導(dǎo)的受體后作用亦不同。因此，腫瘤組織SSTR表達(dá)情況是影響藥物療效的關(guān)鍵。然而，具有抗腫瘤效應(yīng)的SSTR并非在所有的膽囊癌患者的腫瘤組織上表達(dá)。研究表明不同個(gè)體的表達(dá)譜和表達(dá)水平可能決定生長(zhǎng)抑素類似物治療膽囊癌的療效。通過(guò)分析SSTR的表達(dá)對(duì)膽囊癌進(jìn)行選擇性治療可能能提高治療的應(yīng)答率及效果。

本研究采用免疫組化法對(duì)人膽囊癌及正常膽囊組織SSTR亞型的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在上述組織中SSTR1～5均有不同程度的表達(dá)。在膽囊癌及正常膽囊組織中的優(yōu)勢(shì)表達(dá)亞型均為SSTR3，其次是 SSTR1及 SSTR5，表達(dá)最少的是 SSTR2亞型。SSTR1、SSTR3、SSTR5的表達(dá)在膽囊癌組織中均高于正常膽囊組織，且SSTR5的表達(dá)增高具有明顯差異性;而SSTR1及SSTR4的表達(dá)在癌與正常膽囊組織中無(wú)明顯變化。近年研究證實(shí)，SSTR2和SSTR3為介導(dǎo)SSTA抗腫瘤作用的主導(dǎo)亞型，SSTR家族中與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的SSTR亞型目前認(rèn)為是SSTR2和 SSTR3［9］。因此，腫瘤組織中是否有SSTR2和SSTR3的表達(dá)，應(yīng)當(dāng)成為患者是否接受SSTA治療的前提。所以治療膽囊癌應(yīng)該以SSTR3為靶點(diǎn)。

SSTR5的表達(dá)在膽囊癌與正常膽囊組織中具有明顯的差異性，在正常膽囊到癌的過(guò)程中，SSTR5的表達(dá)明顯增高，故SSTR5有可能做為膽囊癌診斷的一個(gè)輔助指標(biāo)。

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