亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        耐培美曲塞人肺癌細胞系的建立

        2012-09-27 06:51:14孟麗娟劉福銀樊衛(wèi)飛蒲驍麟
        醫(yī)學研究生學報 2012年3期
        關鍵詞:培美曲塞抑制率

        楊 民,王 峻,孟麗娟,劉福銀,樊衛(wèi)飛,蒲驍麟

        0 引 言

        肺癌是目前世界上常見的腫瘤相關性死亡原因,已居我國腫瘤發(fā)病及死亡原因首位[1]?,F階段不能手術的中晚期非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)仍采用以化療為主的綜合治療,但耐藥性的出現使得NSCLC的化療療效下降,故對于耐藥基因的研究日益受到重視。本實驗通過體外誘導肺腺癌細胞株A549對培美曲塞產生獲得性耐藥,建立A549培美曲塞耐藥株,為研究肺腺癌中培美曲塞的耐藥機制及耐藥相關基因的探討提供模型。

        1 材料與方法

        1.1 材料 人肺腺癌細胞株A549購于美國標準生物品收藏中心。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM;培養(yǎng)條件:37℃,5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱;2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。細胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等均為Gibco公司產品;MTT為Sigma公司產品;培美曲塞為法國禮來公司產品。

        1.2 方法

        1.2.1 MTT法測 A549的 IC50 將細胞按5×103/孔接種于96孔板,24 h后加入10-2μg/L的培美曲塞,采用 MTT 法[2]分別于培養(yǎng) 24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h和72 h計算出其抑制率。將不同時間點測定的抑制率輸入SPSS統(tǒng)計軟件包,最后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,找出曲線平臺期(曲線變平坦),該時間點作為最佳時間點。按上述相同的方法接種96孔板,24 h后加入不同濃度的培美曲塞(10-1~l0-8μg/L),在最佳時間點處終止培養(yǎng),按上述相同的方法在Dynateeh-MR7000儀上測定各孔570 nm波長處A值,再使用SPSS統(tǒng)計軟件包計算IC50,以所測得IC50濃度為中點,分別以5倍濃度梯度向兩側各延伸3個濃度梯度,以此濃度梯度為加藥濃度,共接種21個孔,每個濃度3孔,再以上述方法重新測出IC50。最后取3個平行孔的均值。

        1.2.2 耐藥的誘導 以1/2 IC50濃度的培美曲塞誘導細胞60 h,轉化為完全培養(yǎng)基培養(yǎng),隔天換液,無菌PBS沖洗以去除死細胞,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,繼續(xù)加入1倍IC50濃度的培美曲塞誘導細胞60 h,隔天換液除去死細胞,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,再以上述方法重新測IC50,并重復上述步驟,直到IC50達到誘導耐藥前的5倍時,即視為獲得性耐藥誘導成功,收集細胞進行下一步實驗,并計算耐藥指數RI(resistance index):

        1.2.3 生長曲線和倍增時間測定 分別取對數生長期的正常A549和耐藥A549細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以3×104/孔種植于24孔板,常規(guī)培養(yǎng),分別于 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 進行計數,每次取3孔計數,計算其平均值,繪制生長曲線。根據Patterson公式計算對數生長期的倍增時間:

        1.2.4 克隆形成率檢測 取生長良好的正常A549和耐藥A549細胞,消化計數,按每平皿400個細胞的濃度種植于直徑35 mm的平皿中,每組接種3個平皿,培養(yǎng)14 d后取出觀察,棄培養(yǎng)液,固定臺盼蘭染色,計數>50個細胞的克隆數,計算克隆形成率,并計算其平均值:

        1.2.5 統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS 13.0軟件進行分析,計量資料用均數±標準差()表示,2組均數比較用t檢驗,以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學意義。

        2 結 果

        2.1 培美曲塞作用A549的IC50測定 根據不同時間點藥物對細胞的抑制率曲線,計算出藥物與細胞的最佳作用時間約為48h。按上述方法將細胞按5×103/孔接種于96孔板,24 h后分別加入不同濃度(10-1~10-8μg/L)的培美曲塞,培養(yǎng) 48 h,計算各濃度的抑制率,計算其IC50為2.75×10-3μg/L。以2×10-3μg/L為基點,5倍濃度差分別向左右延伸,再次計算其IC50,并取3個平行孔的均值,得出A549對培美曲塞的 IC50 為(3.24±0.43) ×10-3μg/L。

        2.2 耐藥的誘導 經上述方法誘導耐藥約3個月,測得其 IC50為(4.8±0.87) ×10-2μg/L,耐藥指數為(14.81±1.47)。與A549細胞相比,差異有顯著性統(tǒng)計學意義,P<0.05。在普通培養(yǎng)液中傳代6周,其耐藥性穩(wěn)定,耐藥指數無明顯下降,認為耐藥誘導成功。

        2.3 A549/Pemetrexed生物學特性

        2.3.1 藥敏試驗 MTT法檢測 A549/Pemetrexed對吉西他濱、紫杉醇、多西他賽、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑的耐藥性,詳見表1。

        表1 A549和A549/Pemetrexed的細胞藥敏結果Table 1 Drug sensitivity of A549 and A549/pemetrexed

        2.3.2 生長曲線和倍增時間測定 圖 1顯示A549/Pemetrexed和A549細胞增殖速度接近,倍增時間分別為(63.03 ±0.98)h和(62.63 ±1.23)h(P>0.05),表明A549/Pemetrexed產生耐藥后其生長未受明顯影響。

        圖1 A549/Pemetrexed和A549細胞的生長曲線Figure 1 Growth curves of A549 and A549/pemetrexed

        2.3.3 克隆形成率檢測 圖2顯示在不同濃度的培美曲塞(10-6~1μg/L)中培養(yǎng)48h細胞克隆形成率,其中A549/Pemetrexed顯示出較高的耐藥性,克隆能力未受到太大影響。

        圖2 A549/Pemetrexed和A549細胞的克隆形成率Figure 2 Cloning efficiency of A549 and A549/pemetrexed

        3 討 論

        培美曲塞是2004年美國食品與藥品管理局批準應用于臨床的多靶葉酸拮抗劑,作用靶點包括嘧啶和嘌呤合成中的多種酶[3],對晚期非小細胞肺癌有較好的療效[4]。Scagliotti等[5]應用培美曲塞/順鉑和吉西他濱/順鉑方案治療1725例非小細胞肺癌,發(fā)現培美曲塞/順鉑與吉西他濱/順鉑方案的總生存率相似,但不良反應更低。Gronberg等[6]報道培美曲塞/卡鉑聯合方案在體力狀況評分=2或年齡>75歲老年人中取得較好的療效,且不良反應可耐受。Peterson等[7]的研究則發(fā)現培美曲塞治療非鱗形細胞肺癌時較鱗形細胞肺癌有更好的療效。故目前培美曲塞可作為老年進展期非鱗形NSCLC的一線治療方案。但隨著化療的進程,其治療后耐藥性的產生影響了其最終療效[3]。因此,建立耐培美曲塞肺癌細胞模型對于闡明耐藥機制,提出預測療效、逆轉耐藥的有效策略具有較好的現實意義。

        目前,腫瘤細胞耐藥細胞系的建立多采用藥物濃度遞增誘導法或高濃度間歇誘導法進行誘導建株[8]。但2種方法各有優(yōu)缺點,前者劑量濃度較難把握,而后者歷時則較長。本研究將2種方法相結合,以培美曲塞對A549進行誘導。經反復作用,A549/Pemetrexed株的耐藥指數達(14.81±1.47),并能穩(wěn)定生長傳代,同時對吉西他濱、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑產生耐藥。A549/Pemetrexed與A549在生長曲線、倍增時間等方面相近,在克隆形成等方面存在差異。因此,本研究建立的A549/Pemetrexed細胞系可用于耐藥相關基因的檢測,為進一步對培美曲塞耐藥機制及相關基因的研究提供實驗模型。

        [1]肖鑫武,宋 勇,朱 虹,等.全身PET/CT在非小細胞肺癌預后判斷中的價值[J].醫(yī)學研究生學報,2010,23(12):1257-1260.

        [2]禹立霞,謝 麗,魏 嘉,等.6種中藥提取物對胃癌細胞株細胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究[J].醫(yī)學研究生學報,2010,23(9):962-966.

        [3]Hagner N,Joerger M.Cancer chemotherapy:targeting folic acid synthesis[J].Cancer Manag Res,2010,2:293-301.

        [4]Vilmar AC,Sorensen JB.Customising chemotherapy in advanced nonsmall cell lung cancer:daily practice and perspectives[J].Eur Respir Rev,2011,20(119):45-52.

        [5]Scagliotti G,Parikh P,von Pawel J,et al.PhaseⅢ study comparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naive patients with advanced-stage NSCLC[J].J Clin Oncol,2008,26(21):3485-3486.

        [6]Gronberg BH,Bremnes R,Aasebo U,et al.Pemetrexed plus carboplatin versus gemcitabine plus carboplatin in the treatment of stage IIIB/IV NSCLC[J].J Clin Oncol(Meeting Abstracts),2007,25(Suppl 18):S7517.

        [7]Peterson P,Park K,Fossella FV,et al.Is pemetrexed more effective in patients with non-squamous histology.A retrospective analysis of a phase III trial of pemetrexed vs docetaxel in previously treated patients with advanced NSCLC[J].Eur J Cancer Suppl,2007,5(Suppl 4):S363.

        [8]Davidson J D,Ma L,Flagella M,et al.An increase in the expression of ribonucleotide reductase large subunit 1 is associated with gemcitabine resistance in non-small cell lung cancer cell lines[J].Cancer Res,2004,64(11):3761-3766.

        猜你喜歡
        培美曲塞抑制率
        中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
        黑龍江科學(2023年8期)2023-06-04 08:40:58
        血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
        奧希替尼聯合培美曲塞、貝伐珠單抗治療EGFR19del/T790M/順式C797S突變肺腺癌1例
        日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
        培美曲塞聯合順鉑對非小細胞肺癌的治療效果評估
        多西他賽聯合順鉑與培美曲塞聯合順鉑治療晚期肺腺癌的隨機對照研究
        雷替曲塞聯合奧沙利鉑治療晚期結直腸癌患者的療效觀察
        培美曲塞與吉非替尼治療老年晚期肺腺癌臨床觀察
        鹽度變化對生物發(fā)光細菌的毒性抑制作用研究
        久久人妻av一区二区软件| 亚洲一区丝袜美腿在线观看| 国产一区二区在三区在线观看| 国内精品免费一区二区三区| 亚洲日本一区二区一本一道| 久久尤物AV天堂日日综合| 丰满的少妇xxxxx青青青| 成人片99久久精品国产桃花岛| 久久夜色精品亚洲天堂| 亚洲综合久久中文字幕专区一区| 优优人体大尺大尺无毒不卡 | 久久九九精品国产av| 国产免码va在线观看免费| 亚洲精品综合欧美一区二区三区| 国产桃色在线成免费视频| 亚洲国产91精品一区二区| 国产av久久久久精东av| 日韩人妻精品无码一区二区三区 | 精品亚洲一区二区三区四区五区 | 97影院在线午夜| 99久久国语露脸国产精品| 国产精品自产拍在线18禁| 成年美女黄网站色大免费视频 | 午夜一区二区三区观看| 日本黄网站三级三级三级| 狠狠色综合播放一区二区| 高清国产精品一区二区| 亚洲精品乱码久久久久蜜桃| 亚洲欧美日韩在线一区| 激情五月婷婷久久综合| 亚洲丝袜美腿在线视频| 少妇饥渴偷公乱a级无码| 国产亚洲高清不卡在线观看| 老岳肥屁熟女四五十路| 日韩av无码久久一区二区| 狠狠噜天天噜日日噜| 手机在线免费看av网站| 久久久久久夜精品精品免费啦| 精品久久人人妻人人做精品| 18禁国产美女白浆在线| 国产精品对白一区二区三区|