楊 民,王 峻,孟麗娟,劉福銀,樊衛(wèi)飛,蒲驍麟
肺癌是目前世界上常見的腫瘤相關性死亡原因,已居我國腫瘤發(fā)病及死亡原因首位[1]?,F階段不能手術的中晚期非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)仍采用以化療為主的綜合治療,但耐藥性的出現使得NSCLC的化療療效下降,故對于耐藥基因的研究日益受到重視。本實驗通過體外誘導肺腺癌細胞株A549對培美曲塞產生獲得性耐藥,建立A549培美曲塞耐藥株,為研究肺腺癌中培美曲塞的耐藥機制及耐藥相關基因的探討提供模型。
1.1 材料 人肺腺癌細胞株A549購于美國標準生物品收藏中心。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM;培養(yǎng)條件:37℃,5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱;2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。細胞培養(yǎng)所需培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶等均為Gibco公司產品;MTT為Sigma公司產品;培美曲塞為法國禮來公司產品。
1.2 方法
1.2.1 MTT法測 A549的 IC50 將細胞按5×103/孔接種于96孔板,24 h后加入10-2μg/L的培美曲塞,采用 MTT 法[2]分別于培養(yǎng) 24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h和72 h計算出其抑制率。將不同時間點測定的抑制率輸入SPSS統(tǒng)計軟件包,最后得到不同時間點的抑制率變化情況,畫出變化的曲線,找出曲線平臺期(曲線變平坦),該時間點作為最佳時間點。按上述相同的方法接種96孔板,24 h后加入不同濃度的培美曲塞(10-1~l0-8μg/L),在最佳時間點處終止培養(yǎng),按上述相同的方法在Dynateeh-MR7000儀上測定各孔570 nm波長處A值,再使用SPSS統(tǒng)計軟件包計算IC50,以所測得IC50濃度為中點,分別以5倍濃度梯度向兩側各延伸3個濃度梯度,以此濃度梯度為加藥濃度,共接種21個孔,每個濃度3孔,再以上述方法重新測出IC50。最后取3個平行孔的均值。
1.2.2 耐藥的誘導 以1/2 IC50濃度的培美曲塞誘導細胞60 h,轉化為完全培養(yǎng)基培養(yǎng),隔天換液,無菌PBS沖洗以去除死細胞,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,繼續(xù)加入1倍IC50濃度的培美曲塞誘導細胞60 h,隔天換液除去死細胞,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,再以上述方法重新測IC50,并重復上述步驟,直到IC50達到誘導耐藥前的5倍時,即視為獲得性耐藥誘導成功,收集細胞進行下一步實驗,并計算耐藥指數RI(resistance index):
1.2.3 生長曲線和倍增時間測定 分別取對數生長期的正常A549和耐藥A549細胞,用0.25%胰蛋白酶消化,以3×104/孔種植于24孔板,常規(guī)培養(yǎng),分別于 24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 進行計數,每次取3孔計數,計算其平均值,繪制生長曲線。根據Patterson公式計算對數生長期的倍增時間:
1.2.4 克隆形成率檢測 取生長良好的正常A549和耐藥A549細胞,消化計數,按每平皿400個細胞的濃度種植于直徑35 mm的平皿中,每組接種3個平皿,培養(yǎng)14 d后取出觀察,棄培養(yǎng)液,固定臺盼蘭染色,計數>50個細胞的克隆數,計算克隆形成率,并計算其平均值:
1.2.5 統(tǒng)計學分析 數據采用SPSS 13.0軟件進行分析,計量資料用均數±標準差()表示,2組均數比較用t檢驗,以P≤0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學意義。
2.1 培美曲塞作用A549的IC50測定 根據不同時間點藥物對細胞的抑制率曲線,計算出藥物與細胞的最佳作用時間約為48h。按上述方法將細胞按5×103/孔接種于96孔板,24 h后分別加入不同濃度(10-1~10-8μg/L)的培美曲塞,培養(yǎng) 48 h,計算各濃度的抑制率,計算其IC50為2.75×10-3μg/L。以2×10-3μg/L為基點,5倍濃度差分別向左右延伸,再次計算其IC50,并取3個平行孔的均值,得出A549對培美曲塞的 IC50 為(3.24±0.43) ×10-3μg/L。
2.2 耐藥的誘導 經上述方法誘導耐藥約3個月,測得其 IC50為(4.8±0.87) ×10-2μg/L,耐藥指數為(14.81±1.47)。與A549細胞相比,差異有顯著性統(tǒng)計學意義,P<0.05。在普通培養(yǎng)液中傳代6周,其耐藥性穩(wěn)定,耐藥指數無明顯下降,認為耐藥誘導成功。
2.3 A549/Pemetrexed生物學特性
2.3.1 藥敏試驗 MTT法檢測 A549/Pemetrexed對吉西他濱、紫杉醇、多西他賽、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑的耐藥性,詳見表1。
表1 A549和A549/Pemetrexed的細胞藥敏結果Table 1 Drug sensitivity of A549 and A549/pemetrexed
2.3.2 生長曲線和倍增時間測定 圖 1顯示A549/Pemetrexed和A549細胞增殖速度接近,倍增時間分別為(63.03 ±0.98)h和(62.63 ±1.23)h(P>0.05),表明A549/Pemetrexed產生耐藥后其生長未受明顯影響。
圖1 A549/Pemetrexed和A549細胞的生長曲線Figure 1 Growth curves of A549 and A549/pemetrexed
2.3.3 克隆形成率檢測 圖2顯示在不同濃度的培美曲塞(10-6~1μg/L)中培養(yǎng)48h細胞克隆形成率,其中A549/Pemetrexed顯示出較高的耐藥性,克隆能力未受到太大影響。
圖2 A549/Pemetrexed和A549細胞的克隆形成率Figure 2 Cloning efficiency of A549 and A549/pemetrexed
培美曲塞是2004年美國食品與藥品管理局批準應用于臨床的多靶葉酸拮抗劑,作用靶點包括嘧啶和嘌呤合成中的多種酶[3],對晚期非小細胞肺癌有較好的療效[4]。Scagliotti等[5]應用培美曲塞/順鉑和吉西他濱/順鉑方案治療1725例非小細胞肺癌,發(fā)現培美曲塞/順鉑與吉西他濱/順鉑方案的總生存率相似,但不良反應更低。Gronberg等[6]報道培美曲塞/卡鉑聯合方案在體力狀況評分=2或年齡>75歲老年人中取得較好的療效,且不良反應可耐受。Peterson等[7]的研究則發(fā)現培美曲塞治療非鱗形細胞肺癌時較鱗形細胞肺癌有更好的療效。故目前培美曲塞可作為老年進展期非鱗形NSCLC的一線治療方案。但隨著化療的進程,其治療后耐藥性的產生影響了其最終療效[3]。因此,建立耐培美曲塞肺癌細胞模型對于闡明耐藥機制,提出預測療效、逆轉耐藥的有效策略具有較好的現實意義。
目前,腫瘤細胞耐藥細胞系的建立多采用藥物濃度遞增誘導法或高濃度間歇誘導法進行誘導建株[8]。但2種方法各有優(yōu)缺點,前者劑量濃度較難把握,而后者歷時則較長。本研究將2種方法相結合,以培美曲塞對A549進行誘導。經反復作用,A549/Pemetrexed株的耐藥指數達(14.81±1.47),并能穩(wěn)定生長傳代,同時對吉西他濱、5氟脲嘧啶、順鉑、卡鉑產生耐藥。A549/Pemetrexed與A549在生長曲線、倍增時間等方面相近,在克隆形成等方面存在差異。因此,本研究建立的A549/Pemetrexed細胞系可用于耐藥相關基因的檢測,為進一步對培美曲塞耐藥機制及相關基因的研究提供實驗模型。
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