李 赟，吳曉濱，杜艷萍，劉中輝，刁德昌，宋 虎，王華攝，彭俊生

0 引 言

IIRI是臨床上比較常見的病理生理過程［1］。如果處理不及時，由IIRI引起的腸道菌群和毒素的移位會導致全身炎癥反應綜合征(systemic inflammation reaction syndrome，SIRS)，甚至遠隔臟器的損傷以至多臟器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)［2］。同時，在消化吸收功能中起重要作用的腸黏膜對缺血性損傷極為敏感，IIRI將不可避免地引起腸道代謝功能的紊亂，而后者可間接表現(xiàn)在門靜脈血代謝物質譜的變化上。

代謝組學(metabonomics)是生物學研究的新的平臺，它是通過考察細胞、組織或生物體受到刺激后代謝產(chǎn)物的變化來研究整個生物體系的一門科學［3］。作為該領域中應用最為廣泛的技術，基于GC/MS的代謝組學分析被認為是疾病診斷和生物標記物鑒定中最具價值和可行性的方法之一［4］。代謝組學方法已被用于研究心和腎等臟器組織的缺血再灌注損傷，在眾多代謝物質中發(fā)現(xiàn)了一些有意義的變化規(guī)律［5－6］。但目前對 IIRI引起的門靜脈血代謝物質譜的變化還知之甚少。

Gln是腸上皮細胞重要的營養(yǎng)物質，在腸道嚴重損傷的情況下可以增加小腸吸收面積，增加腸黏膜的細胞構成［7］。雖然臨床上Gln的應用已很普遍，但是許多的隨機對照研究(randomized controlled trials，RCT)并不能顯示出Gln對重癥病例的積極作用。特別是作為腸內(nèi)營養(yǎng)的一部分，Gln給機體帶來的益處還不是很清楚［8］。所以有必要利用不同技術平臺對Gln在危重癥動物模型中的有效性進行進一步評價。Ala-Gln可作為Gln的供者，在水溶液中性質穩(wěn)定，能耐受高溫消毒，應用起來比較方便［9］。在腸道功能受損的情況下其小腸上的專門載體(二肽載體)能保持較高的轉運能力［10－11］。

本研究旨在發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)給予Ala-Gln和Ala對大鼠IIRI后門靜脈血代謝物質譜的影響，并探討其與腸道黏膜形態(tài)學改變和炎癥反應之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠，體重(250±15)g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供。在溫度約為23℃，濕度約為60%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。大鼠購進后先行適應性喂養(yǎng)7 d。許可證號:SCXK(滬)2007-0005。

1.2 主要試劑 Ala-Gln購自華瑞制藥有限公司，甲醇(色譜純)、N-甲基、N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)和三甲基氯硅烷(TMCS)均購自瑞典Fluka公司，Ala、核糖醇、甲氧胺和吡啶(分析純)均購自美國Sigma公司。

1.3 動物分組、手術與取材 實驗為成組設計。隨機分為假手術(S)組(n=8)、IIRI組(n=8)、Ala-Gln組(n=8)、Ala組(n=8)。缺血前3 d Ala-Gln組和Ala組大鼠經(jīng)口灌胃分別給予Ala-Gln或Ala 0.6 g/(kg·d)，S組和IIRI組大鼠給予同體積的等滲鹽水。手術前禁食12 h，手術步驟:大鼠經(jīng)水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，取腹部正中小切口進入腹腔，切口長度約2 cm。于小腸系膜根部找到SMA，暴露分離在其從腹主動脈剛剛分出的血管根部，并用無損傷血管夾夾住，使其血流阻斷。觀察遠端腸系膜小動脈搏動消失，腸管壁色澤由紅潤變得蒼白，便可確定其阻斷效果。60 min后解除阻斷，確定遠端腸系膜小動脈恢復搏動后縫合腹部切口。S組的大鼠術中暴露分離SMA后不予以阻斷，和其他各組大鼠置于相同的環(huán)境中60 min后關腹。缺血后3 d Ala-Gln組和Ala組大鼠經(jīng)口灌胃分別給予Ala-Gln或Ala，劑量同前;S組和IIRI組大鼠給予相同體積的等滲鹽水。再灌注72 h后再次剖腹，取大鼠門靜脈血4 ml左右，置于抗凝管中。2000 r/min離心20 min，離心半徑13.5 cm，取盡上清血漿，置于－80℃低溫冰箱中保存。同時取回盲部近端10 cm處的小腸組織，用10%的甲醛溶液固定。

1.4 代謝組學分析

1.4.1 血漿的處理及衍生化 參考代謝組學研究中常用的血漿衍生化方法［12］。取200 μl血漿加入800 μl甲醇中以去除血漿中的蛋白質并阻止酶的活性。渦旋震蕩1 min后加入20 μl核糖醇母液作為內(nèi)參。再次渦旋震蕩1 min后于水浴70℃中加熱10 min，離心后取全部上清加500 μl純水和250 μl氯仿。再次離心后取全部上清轉移至干燥密閉的玻璃管中，于60℃氮氣吹干。在吹干的玻璃管中加入50 μl甲氧胺吡啶溶液，水浴中70℃中加熱60 min，渦旋震蕩1 min后加入99 μl MSTFA和1 μlTMCS。常溫下放置1 h后即可上樣進行GC/MS檢測。

1.4.2 GC/MS數(shù)據(jù)采集和處理 應用安捷倫氣相色譜儀系統(tǒng)(6890N)進行氣相色譜分析，上樣量為2.0 μl。進樣口溫度為270℃;進樣口總流速504 ml/min;載氣為氦氣;最高柱溫為300℃。根據(jù)GC/MS總離子流(total ion current，TIC)圖中各峰的保留時間挑選有效的物質峰，對各峰進行積分。利用NIST質譜數(shù)據(jù)庫對總離子流圖中各個物質峰對應的內(nèi)源性物質進行鑒定，內(nèi)源性物質含量直接用圖中相應物質峰的峰面積(豐度)來表示。將每個樣本的處理結果導入SIMGA-P+12.0軟件進行PLS分析。應用PLS分析產(chǎn)生得分圖和載荷圖。得分圖可用來展示組間差異;載荷圖用來計算造成這種區(qū)分的主要差異物質。VIP值是SIMGA-P+12.0軟件對輸入的樣本數(shù)據(jù)矩陣和相應變量進行分解并回歸處理后得到的參數(shù)，用于評價不同代謝物質在樣本區(qū)分中的重要性［13］。VIP值＞1被認為是判斷有意義物質的標準。

1.4.3 制樣緊密度檢測 取同一份血漿樣本按上述方法平行制備8份樣品，進行GC/MS分析，將8張TIC圖重疊發(fā)現(xiàn)共有峰的保留時間重復性良好。計算各峰面積在這8份樣品中的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，結果顯示所挑選的物質峰的RSD均小于15%，符合生物樣品分析的要求。見圖1。

圖1 8個血清平行樣本的總離子流圖用于考察GC/MS制樣緊密度Figure 1 TIC chromatograms of eight parallel serum samples for the validation of precision

1.5 組織學檢查 分離的小腸段經(jīng)過10%的甲醛溶液固定后經(jīng)過脫水、石蠟包埋。切片厚度為5 μm并經(jīng)過蘇木精和伊紅的染色。利用盲法控制的組織學檢查方法進行半定量檢查［14］。具體標準為:0:正常組織學表現(xiàn);1:表面上皮組織輕度斷裂或破裂;2:上皮細胞的缺失及絨毛頂端的損傷;3:黏膜血管充血、出血及局灶性壞死，并有少于一半的絨毛缺失;4:損傷范圍擴大達到一半以上的絨毛。

1.6 門靜脈血細胞因子濃度的檢測 按照酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R＆D Systems，Inc.Minneapolis，MN USA)說明書的要求進行門靜脈血TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10濃度的檢測。

1.7 統(tǒng)計學分析 用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示。多組均數(shù)比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用post-hoc LSD-t檢驗，若不滿足方差齊性則用Tamhane's T2檢驗。門靜脈血葡萄糖、尿素、膽固醇的物質豐度與小腸組織學評分、門靜脈血TNF-α濃度的相關性分析采用Spearman等級相關性分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 門靜脈血代謝組數(shù)據(jù)分析結果 IIRI可引起SD大鼠門靜脈血代謝譜的顯著變化。在PLS分析得分圖上可以看出各組標本的總體分布趨勢:總體上說Ala-Gln組和S組分布地較集中也最為接近;而IIRI組和Ala組的分布比較分散且離S組相距較遠(圖2)。在門靜脈血中鑒定出的內(nèi)源性化合物包括有機酸類、氨基酸類、碳水化合物類及脂和脂肪酸類共22種物質。根據(jù)VIP值(表1)和PLS分析載荷圖我們發(fā)現(xiàn)了3種最具意義的差異物質，分別是葡萄糖(VIP值 =3.36008)、尿素(VIP 值 =2.81043)和膽固醇(VIP值=1.00429)。與S組比較，IIRI后大鼠門靜脈血葡萄糖的豐度明顯降低(P＜0.01);尿素(P＜0.01)和膽固醇(P ＜0.01)豐度明顯升高。Ala-Gln能明顯緩解腸I/R后門靜脈血葡萄糖的降低(P＜0.01)以及尿素(P ＜0.01)和膽固醇(P ＜0.01)的升高;而Ala組門靜脈血這3種物質的豐度與IIRI組比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 不同組別大鼠門靜脈血代謝組數(shù)據(jù)PLS得分圖Figure 2 PLS score plot derived from metabolome data of the portal blood in different groups

表1 門靜脈血中鑒定出的內(nèi)源性物質Table 1 Endogenous metabolites identified in the portal blood samples

2.2 小腸黏膜組織學 S組小腸組織的形態(tài)學表現(xiàn)正常，具有完整的絨毛和腺體結構，在黏膜上皮層沒有看到炎癥細胞的浸潤。IIRI組主要表現(xiàn)為腸上皮壞死伴有局部潰瘍形成，絨毛大面積脫落，腺體結構嚴重破環(huán)和大量炎癥細胞的浸出，組織學評分與S組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而Ala-Gln組則表現(xiàn)為上皮組織局部的紊亂，亦有部分絨毛脫落和少量炎癥細胞的浸潤，與IIRI組比較組織學評分明顯降低(P＜0.05)。但腸內(nèi)給予Ala后小腸組織形態(tài)與IIRI組比較未見明顯好轉(P ＞0.05)。見表2、圖 3。

2.3 門靜脈血細胞因子濃度 IIRI組和Ala組門靜脈血促炎因子(TNF-α、IL-1和 IL-6)濃度較S組均明顯升高(P＜0.01);抗炎因子IL-10濃度較S組明顯降低(P＜0.01)。與 IIRI組比較，腸內(nèi)給予Ala-Gln能夠明顯緩解IIRI后大鼠門靜脈血促炎因子和抗炎因子水平的變化(P＜0.01);Ala組的結果與IIRI組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.4 相關性分析 門靜脈血葡萄糖、尿素、膽固醇的物質豐度與小腸組織學評分、門靜脈血TNF-α濃度之間具有顯著的相關性(P＜0.01)。其中葡萄糖水平與之呈顯著的負相關，而尿素、膽固醇與之呈顯著的正相關。見表3。

表2 小腸組織學評分和門靜脈血的細胞因子濃度()Table 2 Scores of intestinal histology and levels of TNF-α and interleukins in the portal blood()

表2 小腸組織學評分和門靜脈血的細胞因子濃度()Table 2 Scores of intestinal histology and levels of TNF-α and interleukins in the portal blood()

與 S組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 IIRI組比較，ΔP ＜0.05;ΔΔP ＜0.01

組 別 n TNF-α(pg/ml) IL-1(pg/ml) IL-6(pg/ml) IL-10(pg/ml)小腸組織學評分S 組 8 50.75 ±4.40 196.38 ±24.45 260.25 ±22.47 361.38±41.62 0±0 IIRI組 8 614.00 ±23.90＊＊ 610.00 ±15.57＊＊ 560.13 ±193.70＊＊ 152.25 ±10.19＊＊ 3.50 ±0.53＊＊Ala-Gln 組 8 110.25 ±8.86＊＊ΔΔ 298.25 ±66.52*ΔΔ 284.38 ±31.74ΔΔ 260.00 ±28.00＊＊ΔΔ 1.88 ±1.13*Δ Ala組 8 608.13 ±84.88＊＊ 601.25 ±30.77＊＊ 586.00 ±47.88＊＊ 125.00 ±19.61＊＊ 3.13 ±0.83＊＊

圖3 小腸組織的光學顯微鏡表現(xiàn)(HE×400)Figure 3 Light micrographs of the intestinal tissue in different groups(HE×400)

表3 門靜脈血代謝物質(葡萄糖、尿素、膽固醇)豐度與小腸組織學評分門靜脈血 TNF-α濃度之間的Spearman等級相關系數(shù)Table 3 Spearman's rank-correlation coefficients of the abundance of metabolites(glucose，urea，cholesterol)with intestinal histological grades，and TNF-α concentrations in the portal blood

3 討 論

一直以來，研究特殊營養(yǎng)干預后的機體代謝物質總體輪廓的變化是營養(yǎng)代謝組學關注的焦點之一［15］。已有許多研究證實了這樣一個觀點:作為某一疾病或者藥物干預所引起的機體改變可以反映在血液中代謝物質譜的特殊類型上［16］。本實驗創(chuàng)新性地應用代謝組學技術來評價免疫營養(yǎng)物質(Ala-Gln和Ala)在動物模型中的作用，使我們能夠從代謝功能這個更深入的層次去認識免疫營養(yǎng)物質在營養(yǎng)治療中的重要意義。

國外已有文獻報道在IIRI前5 d給予Gln可以明顯提高腸缺血后小鼠的生存率［17］。但是在缺血損傷開始后立即給予Gln卻可能起到相反的結果，推測Gln可能會在缺血后引起中性粒細胞和淋巴細胞的過度激活，而由Gln合成抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)則需要更長的時間［18－19］。已有學者證實SD大鼠經(jīng)過腸缺血期后再灌注72 h能夠為IIRI的研究提供比較理想的動物模型［20］。因此我們選擇從腸缺血前3d開始至再灌注72h(腸缺血當天除外)每天給予免疫營養(yǎng)素干預，再灌注72 h后將大鼠處死取材。

任何造成局部缺血(如腹腔高壓［21］)或嚴重休克的創(chuàng)傷都會引起腸黏膜的損傷，以至于造成胃腸道完整性的破壞［22］。本研究的病理證實IIRI導致了腸黏膜形態(tài)的嚴重損傷，腸內(nèi)給予Ala-Gln可以在一定程度上緩解IIRI所致的黏膜結構的破壞，但Ala并沒有顯示出同樣的作用。已有研究證實口服Gln可以部分緩解IIRI后的黏膜萎縮，表現(xiàn)為增加黏膜重量和DNA含量，增加絨毛高度和隱窩深度［23］。這些改變不可避免地會影響到腸道復雜的代謝過程，其最終結果可表現(xiàn)在生物樣本中眾多小分子物質的改變上［24］。

本實驗中IIRI后門靜脈血葡萄糖水平明顯降低，這與國外的相關研究結果一致［14］。原因可能是動物腸道損傷后進食量減少以及IIRI引起的腸黏膜上皮細胞內(nèi)ATP水平的快速下降直接抑制了葡萄糖的吸收(葡萄糖在腸道的吸收主要依靠Na+依賴的間接消耗 ATP 的過程)［25－26］;另外，在 IIRI后引起的低氧性適應過程中為了給缺氧的組織提供足夠的能量和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，腸組織的無氧糖酵解過程會明顯被激活，而其他蛋白質合成代謝和脂肪酸氧化代謝水平會明顯減弱，這樣更降低了腸組織和門靜脈血的葡萄糖水平［14］。本實驗中Ala-Gln能明顯緩解腸I/R后門靜脈血葡萄糖水平的降低，表現(xiàn)出了Ala-Gln對IIRI后腸道組織能量代謝的穩(wěn)定作用。Ala-Gln是可以被腸黏膜細胞直接利用的能源物質［27］，它可以直接改善腸黏膜細胞內(nèi)能量的供需平衡，維持細胞內(nèi)葡萄糖水平的穩(wěn)定。

IIRI后門靜脈血中尿素水平可能是受到體循環(huán)中尿素增高的影響。在腸道功能嚴重受損的情況下，由于常用能量物質(碳水化合物和脂肪)的吸收和(或)利用能力降低，機體的部分蛋白質被分解供能并最終轉化為尿素氮。另外，IIRI時伴有的腎功能的損害也會使循環(huán)中尿素的廓清率降低［28－29］。而補充外源性Gln能促進腸黏膜內(nèi)谷氨酰胺酶(glutaminase，GA)的表達，提高 GA 的活性［30］，后者可催化Gln生成谷氨酸，進而可通過生成其他氨基酸而促進蛋白質的合成。已有研究證實補充含Gln的二肽可以明顯改善大鼠的蛋白質合成代謝［31］;再者，Gln作為能量代謝底物，可以為機體的生物合成活動提供足夠的能量。

膽固醇酯是細胞膜雙分子層的重要組成部分，IIRI后門靜脈血膽固醇水平的升高反映了腸黏膜上皮細胞的膜結構發(fā)生了破壞。IIRI后引起的氧化應激損傷可以直接引起細胞膜、線粒體膜等生物膜的破壞［25］。再者，細胞膜通透性的增強和鈣泵的失功能會導致細胞內(nèi)鈣離子超負荷，進而激活多種鈣依賴性降解酶［25］，導致細胞膜和細胞器膜的分解，因此膜性膽固醇酯便釋放入血。Ala-Gln能明顯緩解IIRI引起的門靜脈血膽固醇水平升高，顯示出了其對細胞膜和(或)細胞器膜的保護作用。

Ala無法被腸黏膜細胞主動利用進行供能。其在腸黏膜的吸收是主動的耗能過程。根據(jù)腸黏膜上皮細胞能量供給與需求的理論［32］，IIRI后Ala的吸收會進一步增加處于應激狀態(tài)下的腸黏膜上皮細胞對能量的需求，從而加劇細胞內(nèi)ATP水平的下降。本實驗中Ala未表現(xiàn)出對IIRI后腸道代謝狀態(tài)的特殊作用。

炎性反應參與了腸道缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展。TNF-α、IL-1和IL-6被認為是各種刺激引起的炎性反應中的促炎因子。本實驗中IIRI后門靜脈血的TNF-α、IL-1和IL-6的水平明顯增高，提示IIRI會導致腸組織明顯的炎性反應，這與過去的研究結果相一致［33－34］。在腸道組織學檢查中我們發(fā)現(xiàn)了IIRI后中性粒細胞在損傷部位的大量募集和腸屏障明顯的破壞，而促炎細胞因子特別是TNF-α介導了上述效應的發(fā)生［35－37］。IL-10是重要的抗炎細胞因子，可減輕IIRI引起的炎性損傷［38］。我們發(fā)現(xiàn)IIRI組門靜脈血IL-10的水平明顯下調。補充Ala-Gln可以部分緩解IIRI所致的上述細胞因子的變化，提示Ala-Gln可以通過調節(jié)促炎因子與抗炎因子之間的相互平衡來限制IIRI引起的炎性反應。

綜上所述，我們利用代謝組學技術發(fā)現(xiàn)了潛在性的與IIRI相關的門靜脈血代謝物質改變并觀察到腸內(nèi)給予Ala-Gln能夠在一定程度上緩解大鼠IIRI引起的門靜脈血代謝物質譜的紊亂，而Ala并未表現(xiàn)出類似的作用。相關性分析提示該結果與腸黏膜組織形態(tài)學和門靜脈血細胞因子濃度的變化緊密相關。所以我們認為腸內(nèi)給予Ala-Gln有利于維持IIRI后大鼠腸道組織的代謝穩(wěn)定，該作用與Ala-Gln對腸黏膜完整性的保護和對腸道炎癥反應的抑制有關。

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