王軍一，金擴(kuò)世，徐敬龍

（1.臨沂市畜牧站，山東臨沂276004；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春130041；3.濟(jì)南澳利生物工程有限公司，山東濟(jì)南250306）

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV－2）和豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）可以引起以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎及木乃伊胎等為特征的繁殖障礙性疫病，是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要病原。這些病原除了可以通過(guò)接觸傳播外，更能通過(guò)交配或精液輸入而擴(kuò)散。

目前，規(guī)模豬場(chǎng)普遍采用人工授精技術(shù)，2007年，國(guó)家大力實(shí)施生豬良種繁育補(bǔ)貼項(xiàng)目，進(jìn)一步推廣人工授精技術(shù)。因此，如果公豬精液攜帶這些病原，則很容易通過(guò)精液傳播，從而加大了病原傳播的速度和廣度，增加了防控工作的難度和復(fù)雜性。為了解山東地區(qū)種公豬精液的帶毒情況，為制定科學(xué)有效的防控措施提供依據(jù)，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)山東部分種豬場(chǎng)或人工授精站公豬精液進(jìn)行了上述5種病毒的檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 公豬精液樣品 從2007年－2009年共采集來(lái)自山東各地38個(gè)豬場(chǎng)和人工授精站的生產(chǎn)公豬精液樣品727份，其中包括種豬場(chǎng)11個(gè)423份，普通規(guī)模豬場(chǎng)13個(gè)258份，人工授精站14個(gè)46份。

1.1.2 主要試劑 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、Ex－Taq DNA 聚合酶、d NTPs、DNA 標(biāo)準(zhǔn)，以及病毒核酸提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 PCR引物 CSFV采用羅廷榮等［1］報(bào)道的引物，CSFV1：5′－GCT CCT GGT TGG TAA CCT CGG－3′；CSFV2：5′－TGA TGC TGT CAC ACA GGT GAA－3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度分別為508 bp。

PRRSV 采用婁高明等［2］報(bào)道的引物，PRRSV1：5′－ATG GCC AGC CAG TCA ATC A－3′；PRRSV2：5′－TCG CCC TAA TTG AAT AGG TG－3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為433 bp。

PRV引物采用豬偽狂犬病病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB／T18641－2002），預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為217 bp。

PCV－2采用蘆銀華等［3］報(bào)道的引物，PCV－2 1：5′－CCG CGG GCT GGC TGA ACT T－3′；PCV－2 2：5′－ACC CCCGCC ACC GCT ACC－3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為1 154 bp。

PPV 采用趙俊龍等［4］報(bào) 道 的引物，PPV1：5′－TGG TCT CCT TCT GTG GTA GG－3′；PPV2：5′－CAG AAT CAG CAA CCT CAC－3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為445 bp。

引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 精液樣品的前處理與病毒核酸提取 用PBS（p H 7.4，0.01 mol／L）將精液樣品做10倍稀釋，反復(fù)凍融3次，4℃、12 000 r／min離心10 min。取250μL上清按照 TaKaRa MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒核酸。

1.2.2 病原檢測(cè) CSFV和PRRSV檢測(cè)采用同一RT－PCR反應(yīng)條件，反轉(zhuǎn)錄體系：5×buffer 5μL，d NTP（2.5 mmol／L）4μL，RNasin 0.5μL，M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，反轉(zhuǎn)錄引物1μL，模板 RNA 16μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42℃反應(yīng)1 h。PCR反應(yīng)體 系 如 下：上 下游引物 各 0.5μL，d NTP（2.5 mmol／L）2μL，10×buffer 2.5μL，DNA 模板2μL，Taq酶0.3μL（5 U／μL），用滅菌雙蒸水加至總體積25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃40 s，57℃40 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min。PRV檢測(cè)參考豬偽狂犬病病診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（GB／T18641－2002）［3］進(jìn)行；PCV－2參照蘆銀華［4］介紹的PCR 方法進(jìn)行；PPV 參照趙俊龍［5］介紹的PCR方法進(jìn)行。取5μL PCR產(chǎn)物在12 g／L的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳（100 V，30 min），應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察目的片段。

2 結(jié)果

2.1 公豬精液中5種主要病原的檢測(cè)結(jié)果

727份公豬精液樣品中檢出18份CSFV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率2.48%，來(lái)自4個(gè)種豬場(chǎng)、4個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)和1個(gè)人工授精站；檢出27份PRRSV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率3.71%，來(lái)自4個(gè)種豬場(chǎng)、7個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)和2個(gè)人工授精站；檢出7份PRV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率0.96%，來(lái)自2個(gè)種豬場(chǎng)和3個(gè)普通規(guī)模場(chǎng)；檢出33份PCV－2陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率4.54%，來(lái)自4個(gè)種豬場(chǎng)、7個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)和2個(gè)人工授精站；檢出9份PPV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率1.24%，分別來(lái)自2個(gè)種豬場(chǎng)和3個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)。結(jié)果表明有44.74%的豬場(chǎng)精液帶毒（17／38），只有6個(gè)種豬場(chǎng)，5個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)和10個(gè)人工授精站的公豬精液中未檢出病原。具體見(jiàn)表1，表2，表3和圖1。

表1 公豬精液中5種病原檢測(cè)總體情況Table1 The results of 5 pathogen detection in boar semen

表2 種豬場(chǎng)公豬精液中5種病原檢測(cè)結(jié)果Table2 The results of 5 pathogen detection in boar semen of stock farms

表3 普通規(guī)模豬場(chǎng)公豬精液中5種病原檢測(cè)結(jié)果Table3 The results of 5 pathogen detection in boar semen of the ordinary scaled farms

2.2 公豬精液中5種病原混合感染的檢測(cè)結(jié)果

公豬精液中5種病原混合感染的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，有7份樣品為2種以上病原混合感染，陽(yáng)性場(chǎng)次數(shù)達(dá)6個(gè)，其中以PRRSV＋PCV－2混合感染最多，有4份（包括三重感染），陽(yáng)性場(chǎng)次數(shù)達(dá)3個(gè)。另外，CSFV與其他病原混合感染情況也比較突出，有18份CSFV陽(yáng)性樣品中有3份為混合感染，比率高達(dá)16.67%。

表4 精液中5種病原混合感染的檢測(cè)結(jié)果Table4 The results of 5 pathogen mixed infection detected in the boar semen

3 討論

在生豬生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中，優(yōu)良種公豬可以給大量的母豬配種，人工授精技術(shù)的推廣和廣泛應(yīng)用進(jìn)一步凸顯出公豬精液的疫病防控中的源頭地位。很多疫病如豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬細(xì)小病毒病、偽狂犬病、圓環(huán)病毒等都很能夠通過(guò)公豬精液傳播與擴(kuò)散，造成疫病的流行。國(guó)內(nèi)一些單位也先后對(duì)公豬精液攜帶病毒情況進(jìn)行了檢測(cè)。如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的周斌等［5］對(duì)2003年－2004年期間華東5省市17個(gè)大中型豬場(chǎng)送檢的186份中公豬精液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果18份呈PRRSV陽(yáng)性，24份為CSFV陽(yáng)性，其中11份為PRRSV和CSFV混合感染。孫泉云等［6］在2006年4月～10月對(duì)上海及周邊30個(gè)豬場(chǎng)和授精站355份公豬精液進(jìn)行了6種與繁殖障礙相關(guān)病毒的檢測(cè)，結(jié)果除日本腦炎病毒為陰性外，PRRSV、PRV 、CSFV、PPV 和 PCV 均有一定程度流行，并存在混合PRV和PPV感染現(xiàn)象。黃夏等［7］對(duì)采自廣西6市12個(gè)種豬場(chǎng)的441份公豬精液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有75%的豬場(chǎng)公豬精液存在帶毒現(xiàn)象，CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV 和PPV 陽(yáng)性率分別為10.20%、2.04%、7.48%、0.45%和0.45%，總陽(yáng)性率為20.63%。

本試驗(yàn)采用PCR技術(shù)，對(duì)2007年－2009年采集的山東11個(gè)種豬場(chǎng)、13個(gè)普通規(guī)模豬場(chǎng)和14個(gè)人工授精站的共計(jì)727份生產(chǎn)公豬精液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是種豬場(chǎng)、普通規(guī)模場(chǎng)，還是授精站的公豬精液均存在帶毒現(xiàn)象，共檢出陽(yáng)性樣品94份，陽(yáng)性率為12.93%；其中PCV－2和PRRSV陽(yáng)性率最高，分別為4.54%和3.71%；其次是CSFV，陽(yáng)性率達(dá)2.48%；而PRV和PPV也有一定水平帶毒，陽(yáng)性率分別為0.96%和1.24%；另外發(fā)現(xiàn)存在PRRSV、PCV－2和CSFV、PPV等混合感染現(xiàn)象，陽(yáng)性率為0.96%。

與其他單位研究結(jié)果不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)公豬精液中PRRSV和PCV－2陽(yáng)性率最高，而黃夏等［7］報(bào)道CSFV檢出率最高，孫泉云等［6］則發(fā)現(xiàn)PPV陽(yáng)性率最高。造成這種原因，我們考慮是首先2006年下半年－2008年全國(guó)流行高致病性藍(lán)耳病，在此期間不少豬場(chǎng)的公豬被感染，因此精液陽(yáng)性率較高，而其他研究者的工作在疫情暴發(fā)前已基本完成，因此，PPRSV的陽(yáng)性率存在較大差異。由于目前缺乏有效的商品化疫苗，防控PCV－2主要通過(guò)嚴(yán)格的生物安全管理和檢疫凈化等措施，因此管理水平的差距是造成不同地區(qū)、豬場(chǎng)PCV－2陽(yáng)性率差異的關(guān)鍵。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRRSV和PCV－2，以及與其他病原混合感染現(xiàn)象較為普遍。由于PRRSV和PCV－2是免疫抑制性疫病，主要破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，因此對(duì)這兩種疫病的防控應(yīng)高度重視。

種公豬和公豬精液的質(zhì)量直接關(guān)系到養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，在當(dāng)前豬病日趨復(fù)雜化的形勢(shì)下，必須加強(qiáng)對(duì)種公豬和精液的管理。種豬場(chǎng)和規(guī)模豬場(chǎng)應(yīng)建立完善的生物安全體系，減少疫病傳播幾率，提高豬群的整體健康水平；應(yīng)加強(qiáng)對(duì)公豬群的疫病監(jiān)測(cè)，盡早發(fā)現(xiàn)和剔除感染病毒的陽(yáng)性種公豬，徹底切斷傳染源。另外，豬場(chǎng)和授精站在引進(jìn)種公豬和精液前必須嚴(yán)格檢疫（測(cè)），選用無(wú)特定病原的公豬或精液用于授精，充分保證養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）的經(jīng)濟(jì)效益，從而從種源上凈化繁殖障礙性疾病奠定基礎(chǔ)。

［1］羅廷榮，莫 揚(yáng)，吳文德，等.RT－PCR技術(shù)診斷豬瘟的應(yīng)用研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，26（4）：307－310.

［2］婁高明，杜偉賢，謝明權(quán)，等.豬繁殖與呼吸道綜合征RT－PCR診斷方法的建立［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，20（2）：141－144.

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［4］趙俊龍，陳煥春，呂建強(qiáng)，等.豬細(xì)小病毒PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23（2）：142－144.

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［6］孫泉云，周錦萍，張維誼，等.種公豬精液中與繁殖障礙有關(guān)的6種病毒的檢測(cè)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（11）：30－33.

［7］黃 夏，陳義祥，磨龍春，等.應(yīng)用PCR方法對(duì)廣西公豬精液的偽狂犬病、圓環(huán)病毒2型和細(xì)小病毒混合感染情況的檢測(cè)［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2008，33（1）：41－43.