董玉蘭，唐前君，易圖永，肖啟明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

柑橘潰瘍病是一種細(xì)菌性植物病害，因?qū)е轮仓曛θ~及果實(shí)產(chǎn)生潰瘍性病斑而得名，公認(rèn)為世界性的檢疫病害，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[1]。近年來，柑橘潰瘍病的防治已經(jīng)由最初的化學(xué)防治轉(zhuǎn)向更具優(yōu)勢的生物防治[2]。生物防治的優(yōu)勢在于其防治劑只對有害病菌起作用，不僅可避免化學(xué)藥物對農(nóng)產(chǎn)品的污染，而且可保護(hù)生態(tài)環(huán)境免遭破壞[3]。而拮抗微生物的利用又是生物防治措施中的研究重點(diǎn)。有報道稱可從柑橘葉片、果實(shí)及柑橘園土壤中分離出有拮抗作用的菌株[4-5]，因此筆者采集了湖南不同地區(qū)的土壤，擬從中分離純化出對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的微生物，再通過篩選及室內(nèi)防效測試，選取防效最好的菌株，為制備柑橘潰瘍病生物防治劑做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

通過5 點(diǎn)取樣法分別于慈利、郴州、永州、長沙等地的水稻、煙草、柑橘產(chǎn)區(qū)采集了16 個土壤樣品；供試病原菌和供試柑橘苗（臍橙）由國家柑橘改良中心長沙分中心提供；供試培養(yǎng)基有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基（放線菌）、PDA 培養(yǎng)基（真菌）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌分離與純化 取各種土樣10 g，放入裝有90 mL 無菌水（有玻璃珠）的三角瓶中，震蕩1 h；將菌懸液依次稀釋；細(xì)菌采用混勻法，真菌和放線菌采用涂沫法進(jìn)行分離純化[6-7]。從采集到的16個土樣中，共分離出細(xì)菌167 株，放線菌92 株，真菌88 株，總計347 株，用于拮抗試驗(yàn)。

1.2.2 拮抗菌株篩選 采用平板對峙法進(jìn)行初篩，選擇初篩試驗(yàn)中有拮抗效果的菌株進(jìn)行牛津杯法復(fù)篩[8-9]。

1.2.3 拮抗菌形態(tài)學(xué)觀察 采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基表面劃線的方法，觀察菌落形態(tài)；用大腸桿菌和葡萄球菌分別作陰性和陽性對照，對拮抗效果最好的菌株做鏡檢，觀察其顯微結(jié)構(gòu)。鑒定標(biāo)準(zhǔn)參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]進(jìn)行。

1.2.4 拮抗菌室內(nèi)防效試驗(yàn) 選取復(fù)篩試驗(yàn)中拮抗效果明顯的菌株進(jìn)行活體防效試驗(yàn)。供試拮抗菌和供試柑橘潰瘍病菌分別制備成濃度約為1×108cfu/mL 的菌懸液，采用雙面噴施的方法做4 組處理：A 先噴施拮抗菌菌懸液（AM），2 d 后噴施柑橘潰瘍病病原菌菌懸液（PC）；B 同時噴施AM 和PC；C 先噴施PC，2 d 后噴施AM；D 同時噴施PC 和清水做對照，每個處理3 次重復(fù)，每個重復(fù)20 個葉片，接種后，保濕10 d，控制環(huán)境溫度在28℃左右，每隔一個星期觀察一次發(fā)病情況?？?jié)儾》旨墭?biāo)準(zhǔn)參照《農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則》[11]進(jìn)行。

發(fā)病率、病情指數(shù)和相對防效的計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選

平板對峙初篩后得到有拮抗作用的細(xì)菌21株，放線菌6 株，真菌4 株。牛津杯法復(fù)篩后得到3個拮抗效果最好的菌株CZR1、CLH2、CLT3，分別來自郴州仁義鎮(zhèn)水稻土、張家界慈利鄉(xiāng)柑橘園土和張家界慈利鄉(xiāng)柑橘園土。從圖1 可知：CZR1 號菌株的抑菌圈直徑的平均值在43 mm 左右，抑菌圈邊緣模糊；CLH2 菌株的抑菌圈直徑的平均值在55 mm左右，抑菌圈邊緣略微隆起；CLT3 的抑菌圈直徑的平均值在45 mm 左右，抑菌圈邊緣清晰。

圖1 3 株拮抗菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌形態(tài)學(xué)

從圖2 可看出，CZR1 的菌落小而密集，圓滑不透明，不產(chǎn)色素；CLH2 的單菌落表面圓滑且體積大，直徑可達(dá)5 mm 左右，不透明，菌體產(chǎn)綠色素，培養(yǎng)基呈綠色；CLT3 的單菌落大小較為均勻，質(zhì)地緊密不易挑起，干燥多皺的表面產(chǎn)生一層白色絨毛狀的菌絲，與放線菌的菌落形態(tài)相似，其培養(yǎng)基的顏色因菌體產(chǎn)黑色素而發(fā)黑。

圖2 3 株拮抗菌菌落形態(tài)

通過革蘭氏染色、芽孢染色、鞭毛染色及莢膜染色法對三株拮抗效果顯著的菌株光學(xué)顯微觀察，其特征如下：CLT3 ，革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，也無莢膜；CLH2，革蘭氏染色陰性，無芽孢，有單鞭毛和莢膜；CZR1，革蘭氏染色陰性，有芽孢和莢膜，無鞭毛。

顯微結(jié)構(gòu)顯示：CLT3 呈分枝絲狀，氣生菌絲白色，基內(nèi)菌絲深灰色，孢子卵圓形，具典型的放線菌特征；CLH2 為兩端鈍圓的桿狀，有的排成線狀，有的排成短鏈狀；CZR1 為棒狀，同CLH2 一樣表現(xiàn)出細(xì)菌的特征。

表1 3 株拮抗菌生理生化反應(yīng)

2.3 拮抗菌生理生化反應(yīng)

3 株拮抗菌的生理生化測定結(jié)果顯示（表1），3株菌株在氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā)酵等多項生化測試中呈現(xiàn)明顯差異。在15 項檢測中，CLT3與CLH2 有8 項結(jié)果相同，與CZR1 有10 項結(jié)果相同，而CLH2 和CZR1 的測試結(jié)果有11 項相同，CLH2 和CZR1 的親緣關(guān)系較之CLT3 和CZR1、CLT3 和CLH2 較為親近。根據(jù)生理生化測定結(jié)果和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》初步判斷，CLT3 為鏈霉菌屬，CLH2 為假單胞菌屬，CZR1 為伯克氏菌屬。

2.4 拮抗菌溫室防效

不同處理方式的防效結(jié)果顯示（表2），B 處理的發(fā)病率與病情指數(shù)明顯低于A 和C 處理，防效較之A、C 更為明顯。綜合三株拮抗菌看，CLT3 的防效最為突出，尤其是B 處理防效達(dá)到83.85%。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組的柑橘潰瘍病的發(fā)病率和病情指數(shù)均比對照組低，三株拮抗菌的防效基本都在50%以上。這說明在溫室環(huán)境下（28～30℃，濕度40%），以上三株拮抗菌皆表現(xiàn)出較好的防效。

表2 3 株拮抗菌溫室防治效果

3 結(jié) 論

試驗(yàn)從水稻田區(qū)，煙草輪作區(qū)，荒廢的柑橘園區(qū)及無病的園區(qū)采集了16 種土壤樣品，分離純化出31 株拮抗菌株，占總菌數(shù)的8.93%。其中，來自無病柑橘園區(qū)的菌株占所有拮抗菌總數(shù)的74.19%，可見無病的柑橘園區(qū)是分離柑橘潰瘍病菌的主要來源。杯碟法試驗(yàn)結(jié)果顯示，31 株拮抗菌株中CZR1、CLH2 和CLT3 三株菌株的抑菌活性最強(qiáng)，對供試柑橘潰瘍病菌的抑菌圈直徑均大于40 mm。室內(nèi)防效以CLT3 菌株的拮抗效果最突出，相對防效可達(dá)83.85%。

經(jīng)形態(tài)學(xué)研究，CLT3 與放線菌的形態(tài)特征相似，CZR1 和CLH2 兩株菌株的形態(tài)特征與細(xì)菌的較為相符；采用傳統(tǒng)的生理生化測定結(jié)合形態(tài)特征觀察，對三株拮抗菌進(jìn)行了初步分類，結(jié)果表明CLT3 為鏈霉菌屬，CLH2 為假單胞菌屬，CZR1 為伯克氏菌屬。

該研究結(jié)果說明，從土壤中可以篩選出對柑橘潰瘍病有明顯拮抗作用的菌株，豐富了拮抗菌資源庫。三株菌株所屬的具體種屬、分子生物學(xué)特性、殺菌作用機(jī)理，以及在自然環(huán)境中的田間防效有待進(jìn)一步研究。

[1]Lan B T N，Christian V，Philippe J，et al.From Local Surveys to Global Surveillance：Three High-Throughput Genotyping Methods for Epidemiological Monitoring of Xanthomonas citri pv.citri Pathotypes[J].Applied and Environmental Microbiology，2009，75（4）：1173-1184.

[2]史學(xué)群，宋海超，何秋香，等.海南省土壤拮抗放線菌的分離篩選及發(fā)酵液抑菌作用測定[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（4）：332-336.

[3]吳連舉，關(guān)一鳴，逄世峰，等.利用拮抗微生物防治人參、西洋參土傳病害研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（28）：15630-15631，15657.

[4]陳 力，王中康，黃冠軍，等.柑橘潰瘍病生防菌株CQBSO3 的鑒定及其培養(yǎng)特性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（8）：2537-2545.

[5]張洪波，巢 進(jìn)，王躍強(qiáng)，等.柑橘潰瘍病拮抗菌的分離篩選及其田間防效[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，33（5）：605-607.

[6]丁愛云，鄭繼法，時呈奎，等.煙草幾種重要病害拮抗細(xì)菌的篩選[J].中國煙草科學(xué)，1999，（1）：10-11.

[7]錢 恒，段淑蓉.放線菌選擇性分離方法綜述[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2011，17（15）：60-61.

[8]陳 亮，周曉見，董昆明，等.1 株煙草青枯病生防細(xì)菌的分離與鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：104-107.

[9]關(guān)麗杰，楊 迪，譚國梁.黃瓜灰霉病拮抗放線菌的篩選[J].沈陽化工大學(xué)學(xué)報，2010，24（3）：219-221.

[10]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：中國科學(xué)出版社，2001.

[11]姜 輝，曾 伶，王曉軍，等.農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（二）[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.