程春華 楊繼紅 (昆明醫(yī)學院暨天然藥物藥理重點實驗室毒性病理室，云南 昆明 650031)

載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠是研究動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機制和干預(yù)措施較理想的動物模型，是篩選抗AS藥物的良好實驗平臺〔1，2〕。本實驗探討普洱茶對apoE(-/-)小鼠高脂血癥和動脈粥樣硬化的影響。以期為普洱茶防治遺傳因素相關(guān)的高脂血癥和AS提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 40只apoE基因敲除小鼠，8周齡，體重(20±2)g，雄性，購自北京大學實驗動物中心，隨機分為4組，即動脈粥樣硬化模型組、血脂康組、普洱生茶組、普洱熟茶組，每組各10只。10只相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠，8周齡，體重(20±2)g，雄性，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院，為陰性對照組。所有動物均飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境，自由飲水，SPF級全價營養(yǎng)鼠料。

1.2 實驗動物給藥 正常對照組及AS模型組每天均給予蒸餾水0.4 ml灌胃，普洱生茶組和普洱熟茶組則根據(jù)成人每日推薦飲茶劑量的10倍換算為小鼠的給藥劑量為30 mg·kg－1·d－1。血脂康組根據(jù)成人臨床推薦給藥劑量換算成小鼠給藥劑量為10 mg·kg－1·d－1連續(xù)灌胃12 w。每周記錄體重1次，根據(jù)體重，調(diào)整給藥劑量。整個實驗過程中，每組小鼠在移動性、行為和攝食方面無明顯差別。

1.3 血脂的測定 動物禁食12 h后，犧牲動物，取靜脈血2～3 ml，3 000 r/min×10 min離心，取血清上樣于全自動生化分析儀，檢測血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量并計算動脈硬化指數(shù)(AI)。

1.4 hs-CRP的測定 血脂檢測完畢后，剩余血清檢測血中炎癥標志物，按試劑盒操作步驟，小鼠hs-CRP檢測試劑盒購自R＆D公司。

1.5 主動脈病變的形態(tài)學觀察 動物采血后處死，摘取自心臟至髂總動脈分叉處主動脈全段，主動脈根部近心端1.0 cm切下，放入10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定〔3〕。切片厚度為3 μm，進行HE染色，普通光鏡觀察形態(tài)學改變，顯微鏡-微機彩色圖像處理系統(tǒng)測量相關(guān)病理指標。

2 結(jié)果

2.1 血脂水平 見表1。模型組血脂水平較正常對照組明顯升高(P＜0.05)，各藥物組均明顯改善(P＜0.05)。

2.2 各組AI(%)比較 正常對照組為(0.3±0.15)，AS模型組為(4.7±0.76)，普洱生茶組為(2.8±0.6)，普洱熟茶組為(3.0±0.46)，血脂康組為(2.6±1.68)。模型組較正常對照組升高(P＜0.05)。各用藥組較模型組明顯改善(P＜0.05)。

2.3 血清hs-CRP(mg/L)水平 正常對照組為(0.5±0.02)，AS模型組為(0.8±0.04)，普洱生茶組為(0.7±0.03)，普洱熟茶組為(0.7±0.01)，血脂康組為(0.6±0.01)。模型組 hs-CRP水平較正常對照組明顯升高(P＜0.05)，各用藥組較模型組均明顯改善。

表1 普洱茶對apoE基因敲除小鼠AS試驗中血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比較(± s，n=10，mmol/L)

表1 普洱茶對apoE基因敲除小鼠AS試驗中血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比較(± s，n=10，mmol/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.05;與AS模型組比較:2)P＜0.05

組別TG TC LDL-C HDL-C正常對照組0.7±0.30 2.60±0.39 0.60±0.32 1.9±0.17 AS模型組 2.2±0.851)45.4±6.351)37.2±6.051)7.9±1.081)普洱生茶組 0.9±0.202)23.1±2.872)17.0±2.872)6.1±1.072)普洱熟茶組 0.8±0.352)21.7±3.992)16.4±3.592)5.3±0.422)血脂康組 1.2±0.562)16.2±7.012)12.0±6.052)4.2±1.122)

2.4 主動脈病理學檢查 飼養(yǎng)12 w后，正常對照組主動脈壁厚薄均勻，內(nèi)膜、中膜和外膜未見異常;內(nèi)膜完整，未見泡沫細胞聚集，無動脈粥樣硬化病變形成。模型組主動脈壁AS各期病變均可見，可見由大量泡沫細胞形成的脂紋脂斑期病變，也可見由纖維帽覆蓋的纖維斑塊期病變及由大量泡沫細胞及膽固醇結(jié)晶形成的粥樣斑塊期病灶，且斑塊較厚，纖維帽較薄，脂質(zhì)核心較大，泡沫細胞及膽固醇結(jié)晶較多，與管壁黏附不緊密，有脫落，內(nèi)膜完整性破壞，大量泡沫細胞形成和堆積，突向管腔，主動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細胞下和中膜間隙明顯增寬，動脈管壁厚薄不均，內(nèi)膜明顯增厚，外膜可見炎細胞浸潤，形成明顯動脈粥樣硬化斑塊。而普洱生茶組與普洱熟茶組動脈粥樣硬化程度與AS模型組相比明顯減輕，多為早期粥樣硬化，管壁可見輕度隆起和增厚，泡沫細胞聚集程度較AS模型組減輕、動脈粥樣硬化斑塊面積和斑塊數(shù)量較AS模型組少。見圖1，圖2。

2.5 主動脈粥樣斑塊面積定量分析 見表2。

2.6 主動脈損傷病變程度的比較 見表3。

圖1 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠AS主動脈病理圖片(HE，×20)

表2 普洱茶抗apoE基因敲除AS小鼠主動脈斑塊面積定量分析

表3 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化試驗主動脈損傷病變程度

圖2 普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化主動脈病理圖片(HE，×40)

2.7 主動脈粥樣斑塊數(shù)量分析 apoE(+/+)對照組斑塊數(shù)量0個;apoE(-/-)對照組斑塊數(shù)量15個;apoE(-/-)普洱生茶組斑塊數(shù)量12個;apoE(-/-)普洱熟茶組斑塊數(shù)量10個;apoE(-/-)市售品組斑塊數(shù)量9個。

3 討論

現(xiàn)在多采用apoE(-/-)小鼠來研究AS。因此目前它已成為研究動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的細胞與分子機制和研究治療手段的極佳實驗動物模型。

采用基因敲除(基因打靶)技術(shù)建成的apoE基因敲除小鼠動物模型，促進了對高脂血癥和AS發(fā)病機制以及藥物干預(yù)措施等方面的新探索，成為目前在AS研究領(lǐng)域中應(yīng)用最多的基因工程動物。西藥對apoE基因敲除小鼠AS的干預(yù)，已報道α-受體阻滯劑(哌唑嗪)、血管緊張素受體拮抗劑(氯沙坦)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(卡托普利)、調(diào)脂藥(他汀類藥物如普伐他汀、辛伐他汀等，普羅布考)、雌激素等，取得較多研究成果〔4，5〕。中醫(yī)藥對apoE基因敲除小鼠AS的干預(yù)在國內(nèi)尚處于起步階段，普洱茶抗apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的研究就更少了。

本實驗用普通飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠與apoE(-/-)小鼠，試驗周期為3個月，是為初步探討普洱茶對遺傳損傷(apoE基因缺失)所造成的高脂血癥和動脈粥樣硬化的影響。試驗結(jié)果顯示，給予普通飼料，AS模型組與正常對照組血脂和主動脈組織病理學上即出現(xiàn)明顯差異。至于給予apoE(-/-)小鼠高脂飲食所引起的遺傳飲食復(fù)合型AS動物模型，將有待深入研究。

普通飼料喂養(yǎng)條件下，C57BL/6J小鼠脂質(zhì)代謝正常，不會出現(xiàn)高脂血癥和動粥樣硬化病變，而apoE(-/-)小鼠具有嚴重的脂質(zhì)代謝紊亂和典型的動脈粥樣硬化斑塊病變。普洱生茶和普洱熟茶有降低高脂血癥的作用，其降血脂的作用可能與普洱茶中所含茶多酚及過程中產(chǎn)生的他汀類物質(zhì)有關(guān)。

與C57BL/6J小鼠體內(nèi)炎癥標志物水平相比，apoE(-/-)小鼠體內(nèi)炎癥標志物水平升高，普洱生茶和普洱熟茶有降低血清超敏C-反應(yīng)蛋白的作用，提示炎癥對動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展可能起著重要的作用，抑制炎癥有望控制AS的發(fā)生和發(fā)展。普洱生茶和普洱熟茶可降低動脈粥樣硬化指數(shù)，提示二者有抗動脈粥樣硬化的作用，其具體作用機制還不甚清楚，除與抗脂質(zhì)過氧化外，可能還與抗炎癥有關(guān)。

1 劉龍濤，張文高，鄭廣娟.載脂蛋白E基因敲除小鼠在動脈粥樣硬化研究中的應(yīng)用〔J〕.山東生物醫(yī)學工程，2002;21(4):39-42.

2 Smith JD，Breslow JL.The emergence of mouse models of atheroselerosis and their relevance to clinical research〔J〕.J Int Med，1997;242(2):99-109.

3 許淑云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:202-4.

4 Plum AS，Smith JD，Tony Hayek，et al.Severe hypercholesterolemia and atheroslerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES Cells〔J〕.Cell，1992;71(10):343-53.

5 高凌云，何作云，牟 嬌.羅格列酮對apoE基因敲除小鼠血漿高敏C-反應(yīng)蛋白水平的影響〔J〕.重慶醫(yī)學，2006;2(6):34-8.