李保森 孫 穎 張連業(yè) 張 政 張 偉 趙 軍 滕光菊 常彬霞 王福生 鄒正升

人在幼年感染HBV后多數(shù)進(jìn)展為慢性乙型肝炎[1]，而成人感染HBV后可表現(xiàn)為多種形式，如急性自限性肝炎、慢性乙型肝炎（CHB）或急性肝衰竭。CHB患者在一些誘因下可發(fā)生肝衰竭，被稱為慢加急性肝衰竭（Acute-on-chronic liver failure，ACLF）[2]。ACLF患者病情重，治療難度大，病死率高[3～5]。在中國(guó)，超過(guò)80%以上的肝衰竭患者為慢加急性乙型肝炎肝衰竭（Acute-on-chronichepatitisB liver failure，ACHBLF）。然而，目前對(duì)于導(dǎo)致ACLF的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[6]。

樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）是體內(nèi)最主要的抗原提呈細(xì)胞，其中 mDCs可表達(dá) Toll樣受體（TLRs）3、4、7 和8，主要產(chǎn)生IL-12，發(fā)揮抗原提呈功能；而漿性DC細(xì)胞（pDCs）則選擇性表達(dá)TLR7和TLR9，是產(chǎn)生I型干擾素（IFNs)最主要的細(xì)胞[7]。最近有研究表明，肝組織內(nèi)DC細(xì)胞在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體的局部免疫反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用[8，9]。在正常生理?xiàng)l件下，肝內(nèi)DCs主要產(chǎn)生IL-10，以維持肝臟的免疫耐受環(huán)境[10]。在肝炎病毒感染后，機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞可以選擇性地被募集到肝內(nèi)，從而激發(fā)過(guò)量的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷[11～13]。最近，研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病人肝內(nèi)DCs亞群處于功能紊亂狀態(tài)[14]，但肝內(nèi)DCs數(shù)量和功能特點(diǎn)尚不清楚。本研究分析了11例接受肝移植的ACHBLF患者肝組織DC亞群的數(shù)量及功能特點(diǎn)，以闡明其在ACHBLF發(fā)病中的作用。

資料與方法

一、資料來(lái)源 收集2007年以來(lái)在我院接受肝移植的ACHBLF患者11例，術(shù)前一天的臨床資料見(jiàn)表1。另選慢性乙型肝炎患者10例和健康人（肝移植供體）5例。ACHBLF診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[15]；慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》[16]。該研究獲得我院倫理委員會(huì)的審核，患者簽署知情同意書(shū)。

表1 11例ACHBLF患者肝移植前臨床資料

二、外周血DC細(xì)胞表面標(biāo)記及亞群的檢測(cè) 采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血及肝內(nèi)DC亞群，即參照文獻(xiàn)[17]分離外周血PBMC和肝臟內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞（liver-infiltrating lymphocyte，LIL），將細(xì)胞懸浮到含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×106/ml。取細(xì)胞懸液250μl，分別加人以下兩組熒光抗體:①Linl-FICT（CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56-FITC）、CD123-PE、HLA-DR-PerCP（美國(guó) BD 公司） 各 10μl；②Linl-FITC、CDllc-PE、HLA-DR-PerCP（美國(guó)BD公司）各10μl，室溫避光孵育 20min，PBS洗滌細(xì)胞 2次，1500rpm離心5min，棄上清，1%多聚甲醛固定，24h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Lin-1-HLA-DR+CD11c+細(xì)胞為 mDC，而Lin-1-HLA-DR+CD123c+細(xì)胞為pDC。檢測(cè)結(jié)果采用FACSCalibur配置的CellQuest軟件進(jìn)行分析。

三、mDC和pDC功能檢測(cè) 將分離的PBMCs或LILs細(xì)胞懸浮到含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×106/ml。在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，加入PolyI:C（終濃度為26.5μg/ml）刺激mDC，加入CpG2216（終濃度為6μg/ml）和 IL-3（終濃度為 10ng/μl）刺激 pDC，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。37℃、5%CO2孵箱孵育24h，收集培養(yǎng)上清，置-80℃保存。采用ELISA法檢測(cè)IFN-α、IL-12和IL-10水平。

四、肝內(nèi)pDC和mDC鑒定 采用肝活檢取得肝組織。采用免疫組化法，取新鮮肝組織，采用OCT包埋，置于-80℃冰箱保存。取OCD包埋的凍存肝組織，用冷凍切片機(jī)切片，厚5μm，室溫放置30min，丙酮固定 10min，PBS洗滌3遍；以0.3%過(guò)氧化氫孵育10min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。然后，分別加入pDC特異性抗體BDCA-2（Clone AC144，Miltenyi公司）和mDC特異性抗體，即抗-CD11c（Clone B-ly6，BD Pharmingen 公司） 4℃孵育、過(guò)夜。取扁桃體作為陽(yáng)性對(duì)照，同型抗體（鼠抗人IgG1）為陰性對(duì)照，加入二抗并顯色，陽(yáng)性細(xì)胞被染成紅色。在400倍光鏡下，隨機(jī)挑選10個(gè)視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。

結(jié)果

一、ACLF患者外周血及肝內(nèi)pDC和mDC分布情況 肝內(nèi)pDCs百分比明顯高于其外周血（圖1A，P=0.039），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但肝內(nèi)mDCs的頻率卻與外周血類(lèi)似（P=0.617），兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1B），提示ACLF患者pDCs可能已向肝內(nèi)聚集。

二、PBMCs及LILs分泌細(xì)胞因子情況 我們以IFN-α分泌能力來(lái)判斷pDC功能，以IL-12分泌能力判斷mDC的功能。以PolyI:C刺激mDC，以CpG2216和IL-3刺激pDC培養(yǎng)后，上清液IFN-α和IL-12分泌增加，但LILs分泌細(xì)胞因子的能力較PBMCs明顯降低，而分泌IL-10的能力卻較PBMCs明顯升高（圖2）。

圖2 ACLF患者LIL和PBMC分泌細(xì)胞因子能力比較

三、ACHBLF患者肝內(nèi)DC亞群情況 ACLF患者肝內(nèi)大量聚集BDCA-2陽(yáng)性的pDCs和CD11c陽(yáng)性的mDCs；CHB患者DC浸潤(rùn)較少，健康人肝細(xì)胞內(nèi)幾乎見(jiàn)不到DC聚集（圖3）。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，三組之間肝內(nèi)pDCs和mDCs之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為P=0.003和P＜0.001）。

圖1 ACLF患者外周血PBMCs及肝內(nèi)LILs中DCs分布A：外周血PBMCs及肝內(nèi)LILs中pDCs分布；B：外周血PBMCs及肝內(nèi)LILs中mDCs分布

討論

研究證實(shí)，免疫應(yīng)答在機(jī)體免疫病理和病毒清除方面發(fā)揮著雙重作用[18]，特別是肝內(nèi)免疫反應(yīng)強(qiáng)弱顯著影響著HBV感染的疾病進(jìn)展。根據(jù)表型和功能的不同，DC主要分為mDC和pDC兩個(gè)主要亞群：前者主要分泌IL-12，介導(dǎo)T輔助細(xì)胞向TH1轉(zhuǎn)化，而后者則專職產(chǎn)生IFN-α，可直接發(fā)揮抗病毒作用。肝衰竭患者肝內(nèi)DC亞群的分布特點(diǎn)尚不清楚[8，9]。我們?cè)?1例接受肝移植的ACHBLF患者肝臟組織初步明確了pDCs和mDCs亞群的頻率、分布和功能，從而為肝衰竭的發(fā)生機(jī)制研究提供了重要的依據(jù)。

Rastogi A等研究認(rèn)為，肝組織學(xué)改變可以作為判斷ACLF患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[19]。我們發(fā)現(xiàn)ACLF患者肝內(nèi)DC浸潤(rùn)數(shù)量明顯高于慢性乙型肝炎及正常人，而肝內(nèi)pDCs數(shù)量明顯高于外周血，說(shuō)明pDC有可能已向肝內(nèi)聚集，而肝內(nèi)mDCs數(shù)量與外周血相近[20]。

研究發(fā)現(xiàn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝內(nèi)激活的DC可產(chǎn)生IFN-α，從而發(fā)揮潛在的對(duì)抗HBV感染的免疫功能[21]。IFN-α也是主要的NK細(xì)胞激活因子。在CHB患者，激活的NK細(xì)胞可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-相關(guān)的細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)配基（TRAIL）介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[22]。通過(guò)研究肝內(nèi)pDC亞群的功能特點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)，CpG2216可激活肝內(nèi)pDC，使之產(chǎn)生IFN-α，而ACHBLF患者肝內(nèi)pDC來(lái)源的IFN-α可能是觸發(fā)肝內(nèi)免疫反應(yīng)的主要因子，因?yàn)轶w外研究發(fā)現(xiàn)CpG2216激活肝內(nèi)的pDC產(chǎn)生IFN-α后可以促進(jìn)LILs產(chǎn)生IL-12和IL-10。前者與乙型肝炎肝衰竭密切相關(guān)[23]，而后者是病毒感染后抑制免疫反應(yīng)的主要因子。在肝衰竭及慢性乙型肝炎患者外周血IL-10水平明顯升高[24]。我們用CpG2216刺激ACHBLF患者LILs，使其產(chǎn)生高水平的IL-10，可能能減輕ACHBLF患者的肝病癥狀。

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