李 祥 鄒立林 呂建新 高基民

(溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

丙型肝炎病毒Core蛋白類病毒顆粒的表達(dá)及純化

李 祥 鄒立林 呂建新 高基民

(溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035)

目的 通過PCR將丙肝病毒(HCV)Core與蜂毒素信號(hào)肽(Mel)進(jìn)行融合，構(gòu)建到pIZ/V5載體上獲得pIZ/V5-Core-Mel表達(dá)載體。方法 將pIZ/V5-Mel-core穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，經(jīng)Zeocin抗性篩選，獲得單克隆抗性細(xì)胞株。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明獲得穩(wěn)定表達(dá)Mel-core的細(xì)胞系Sf9-Core。對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞系Sf9-Core的上清進(jìn)行離心純化并Western印跡檢測(cè)。結(jié)果 在上清離心純化的樣品中有HCV Core形成的類病毒顆粒(VLPs)。透射電鏡顯示Core蛋白能自組裝成直徑約30 nm的球形顆粒。結(jié)論 該研究成功構(gòu)建了HCV Core與蜂毒素信號(hào)肽的融合蛋白并在Sf9細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，在細(xì)胞培養(yǎng)的上清中獲得了VLPs。

丙型肝炎病毒;Core蛋白;類病毒顆粒

納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將DNA和RNA等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，同時(shí)也在顆粒表面耦聯(lián)特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等，通過靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療。已有研究表明以納米顆粒為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體在基因治療中顯示了良好的運(yùn)用前景。丙型肝炎病毒歸屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬〔1〕，為有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)9.4～9.6 kb，包括一個(gè)單一的9 030～9 099 nt的大開放閱讀框，其編碼一個(gè)3 010～3 033 aa的多聚蛋白前體〔2～5〕，從N端到C端，HCV蛋白的排列順序?yàn)?C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。 電 鏡 下HCV為直徑60～75 nm的顆粒，其表面有8～15 nm的刺突〔6〕，NP-40處理除去包膜后可得直徑為45～55 nm的二十面體的核衣殼〔7，8〕，而核衣殼蛋白就是Core蛋白。HCV Core蛋白是構(gòu)成病毒粒子的重要成分，同時(shí)也扮演著重要的調(diào)控病毒本身以及病毒與宿主細(xì)胞相互作用的重要角色。本研究利用HCV Core蛋白這種自我組裝成類病毒顆粒的特性，構(gòu)建了HCV Core與蜂毒素信號(hào)肽的融合蛋白并在Sf9細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)將形成的類病毒顆粒(VLPs)分泌到細(xì)胞外，為其用于藥物和基因轉(zhuǎn)運(yùn)的納米顆粒載體研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 實(shí)驗(yàn)所使用的昆蟲細(xì)胞系為Sf9。Sf9來源于Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)卵巢細(xì)胞，由中國科學(xué)院武漢病毒研究所中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，武漢)。Sf9傳代培養(yǎng)采用25 cm2的培養(yǎng)瓶以單層細(xì)胞的形式多次傳代，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的Grace培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司)，培養(yǎng)溫度為27℃。

1.2 主要試劑和儀器 限制性核酸內(nèi)切酶、核酸分子量Marker，T4 DNA連接酶等及其配套緩沖溶液均購自TaKaRa公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自V-GENE公司。HCV Core抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自深圳晶美生物公司;NBT和BCIP溶液購自碧云天生物公司。

1.3 pIZV5-Mel-Core的構(gòu)建 以pBRTM/HCV1-3011為模板進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增目的片段。上游引物P1:5'GGG GAA TTC ATG AAA TTC TTA GTC AAC GTT GCC CTT GTT TTT ATG GTC GTG TAC ATT TCT TAC ATC TAT GCG ATG AGC ACG AAT CCT AAA C3'，下游引物 P2:5'GGG GCG GCC TAG GCT GAA GCG GGC ACA 3'(斜黑字體為酶切位點(diǎn)，黑粗字體為Mel序列)。PCR條件為:94℃變性5 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 50 s，72℃ 聚合延伸5 min，共循環(huán)30次。同條件做一管陰性對(duì)照。用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物回收純化，然后與pMD-18T進(jìn)行連接。用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增后，用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒用于核酸測(cè)序。經(jīng)測(cè)序正確后，用EcoRⅠ和NotⅠ酶切pMD-18TMel-Core質(zhì)?；厥誐el-Core目的片段，克隆到pIZV5載體的EcoRⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建成pIZV5-Mel-Core。

1.4 Zeocin對(duì)Sf9細(xì)胞最小致死濃度確定 在35 mm的培養(yǎng)皿中接種1×106的Sf9細(xì)胞，28℃培養(yǎng)過夜;棄去上層培養(yǎng)基，加入2 ml新鮮的培養(yǎng)基，依次加入不同濃度的Zeocin:0、50、200、400和600 μg/ml，每個(gè)濃度進(jìn)行3復(fù)孔觀察。28℃培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)10～14 d，觀察細(xì)胞死亡情況，以高于殺死全部細(xì)胞最小Zeocin濃度的一個(gè)梯度為篩選濃度。以篩選濃度的一半為克隆細(xì)胞維持培養(yǎng)的濃度。

1.5 pIZV5-Mel-Core穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 在35 mm的培養(yǎng)皿中接種1×106的Sf9細(xì)胞，28℃培養(yǎng)過夜;棄去上層培養(yǎng)基，加入1 ml不含血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞兩次，再加入1 ml不含血清的培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)0.5 h以上;在細(xì)胞室中將1 μg DNA與8 μl cellfectin分別用無血清 Grace稀釋至50 μl，5 min后將DNA加入稀釋后的cellfectin中，每隔5 min輕輕混勻一次，45 min后在聚丙烯管中輕輕加入900 μl不含血清的Grace培養(yǎng)基，混勻。棄去35 mm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，加入含有轉(zhuǎn)染混合物的Grace培養(yǎng)基，28℃溫箱培養(yǎng);6 h后用含10%血清的Grace培養(yǎng)替換原有的培養(yǎng)基。2 d后將細(xì)胞傳代60 mm培養(yǎng)皿中，用10%FBS的 Grace培養(yǎng)基(含600 μg/ml Zeocin)培養(yǎng)細(xì)胞，每3天換液，篩選培養(yǎng)2～3 w。利用細(xì)胞克隆環(huán)獲取細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。待24孔板內(nèi)的克隆細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，依次轉(zhuǎn)入6孔板、60 mm，100 mm平皿進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。平皿內(nèi)的克隆細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，改用10%FBS的Grace培養(yǎng)基(含300 μg/ml Zeocin)維持培養(yǎng)細(xì)胞。2 w后，凍存部分細(xì)胞于液氮中，剩余細(xì)胞繼續(xù)用用10%FBS的Grace培養(yǎng)基(含300 μg/ml Zeocin)維持培養(yǎng)。

1.6 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Sf9-Core的鑒定 在35 mm的培養(yǎng)皿中接種1×106的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Sf9-Core，24 h后收取細(xì)胞。總RNA按照Trizol(Gibco-BRL)操作指南進(jìn)行提取。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，用oligo(dT)15引物引導(dǎo)第一鏈cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為PCR模板，用HCV Core特異性引物P3:5'ATG AGC ACG AAT CCT AAA C 3'和P4:5'TGT CGT GGC GAT TGT AGC ACG 3'進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min進(jìn)入循環(huán)過程;94℃變性30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)。最后以72℃延伸10 min。取3 μl在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析結(jié)果。

1.7 穩(wěn)定細(xì)胞株Sf9-Core類病毒顆粒的純化 用100 mm平皿進(jìn)行大量培養(yǎng) Sf9-Core細(xì)胞，當(dāng)平皿內(nèi)的細(xì)胞密度達(dá)80% ～90%時(shí)收細(xì)胞上清。5 000 r/min離心10 min以除去細(xì)胞碎片。收集上清，用0.45 μm濾器過濾。35 000 r/min離心4 h，去上清，將沉淀融于PBS。用30%，40%，50%蔗糖鋪好梯度，4℃放置過夜，將融于 PBS的沉淀緩慢加在最上層，35 000 r/min離心4 h。在30%與40%蔗糖之間有一條明顯的條帶。緩慢將此條帶吸出，與PBS混勻，35 000 r/min離心4 h，以去除蔗糖。沉淀融于PBS，置于4℃保存，備用。

1.8 純化產(chǎn)物透射電鏡鑒定 取少量純化的樣品滴于銅網(wǎng)，2%磷鎢酸負(fù)染2 min，室溫下干燥5 min，樣品置于透射電子顯微鏡(H-7000FA)下觀察顆粒形態(tài)。

1.9 純化產(chǎn)物Western印跡鑒定 用鼠抗HCV Core抗體按1∶1 000進(jìn)行稀釋，與純化的類病毒顆粒進(jìn)行Western雜交，以此來檢測(cè)純化的類病毒顆粒上Core蛋白的存在。

2 結(jié)果

2.1 pIZV5-Mel-Core載體的構(gòu)建 以pBRTM/HCV1-3011為模版，以P1和P2為引物通過PCR擴(kuò)增獲得Mel-Core片段(圖1)，然后克隆到pMD-18T載體上。測(cè)序正確后經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ酶切克隆到pIZV5上獲得pIZV5-Mel-Core(圖2)。

圖1 Mel-HCV Core PCR結(jié)果

圖2 pIZV5-Mel-Core酶切結(jié)果電泳鑒定

2.2 Zeocin篩選濃度的確定 培養(yǎng)2 w后，400 μg/ml以上組的CHO細(xì)胞已全部死亡，確定600 μg/ml為理想篩選濃度，300、200、50 μg/ml時(shí)細(xì)胞死亡率分為 95%、80%、60%，其中300 μg/ml為克隆細(xì)胞維持培養(yǎng)的濃度。

2.3 pIZV5-Mel-Core穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Sf9-Core的篩選鑒定 質(zhì)粒pIZV5-Mel-Core轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞2 d后，在培養(yǎng)基中加入400 μg/ml的Zeocin。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸死亡，轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞具有Zeocin抗性存活下來，不斷增殖成為細(xì)胞克隆。當(dāng)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Sf9-Core細(xì)胞后，用Trizol收集1.5×106的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，用OligodT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄完畢后取部分產(chǎn)物用P3和P4作為引物進(jìn)行PCR，同時(shí)以轉(zhuǎn)染空載體pIZV5的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。RTPCR結(jié)果表明，僅在轉(zhuǎn)染組擴(kuò)增獲得636 bp的片段，而對(duì)照組無此條帶(圖3)，說明Mel-Core基因片段已經(jīng)穩(wěn)定整合到Sf9細(xì)胞基因組中。

圖3 pIZV5-Mel-Core穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞RT-PCR鑒定結(jié)果

2.4 HCV Core類病毒顆粒的純化及鑒定 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞Sf9-Core的上清，通過超速離心和梯度離心可得到純化的類病毒顆粒。TEM電鏡觀察結(jié)果顯示離心純化的產(chǎn)物主要由一種大小均勻、直徑約30 nm的球形顆粒構(gòu)成 (圖4)。為確定Core蛋白是否組裝入類病毒顆粒，我們用鼠抗HCV Core抗體按1∶1 000稀釋，與純化的類病毒顆粒進(jìn)行Western雜交。結(jié)果顯示有一條約23 kD的雜交帶存在(圖5)，表明HCV Core蛋白在類病毒顆粒中的存在。

圖4 電鏡觀察純化類病毒顆粒

圖5 Western印跡檢測(cè)純化類病毒顆粒中的HCV Core蛋白

3 討論

HCV是輸血后及散在性的非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病因。全世界目前約有1.7億人被HCV感染，急性感染者中有80%轉(zhuǎn)為慢性，其中20%在10～20年后將發(fā)展為肝硬化，1% ～5%可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌(HCC)〔10〕。到目前為止，尚沒有有效的治療HCV慢性感染的藥物和防止HCV感染的疫苗。VLPs和類核衣殼顆粒(CLPs)是不含病毒基組，不具有感染能力的結(jié)構(gòu)，但在某些情況下能有效地產(chǎn)生保護(hù)的免疫性來抵抗親代病毒的感染。如已經(jīng)在使用的抗HBV的疫苗是用HBV的類病毒顆粒生產(chǎn)的，還有最近使用的人乳突淋瘤病毒(HPV)疫苗也是用它的類病毒顆粒產(chǎn)生的〔10，11〕。同時(shí)，VLPs和CLPs也成了藥物和基因治療的載體〔12，13〕。1998年，Baumert等〔14〕人首次利用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生了由HCV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)后自組裝形成的類病毒顆粒，其直徑40～60 nm，存在于細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的空泡里，浮力密度等物化性質(zhì)與病人血清中的病毒顆粒很相似。Falcon等〔15〕人則在畢赤酵母中表達(dá)了23 kD和21 kD兩種形式的Core蛋白，并發(fā)現(xiàn)其可包裝成直徑20～30 nm的類核衣殼顆粒;后來又有人將HCV結(jié)構(gòu)蛋白在昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，得到了HCV的VLPs〔16〕。但這些病毒顆粒都存在于細(xì)胞質(zhì)中，隨后病毒顆粒的純化費(fèi)時(shí)又浪費(fèi)金錢，更重要的是純化過程會(huì)改變VLPs的形態(tài)和活性給后續(xù)的研究帶來非常不便。

本研究利用HCV Core蛋白這種自我組裝成VLPs的特性，構(gòu)建了HCV Core與蜂毒素信號(hào)肽的融合蛋白并在Sf9細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，并在細(xì)胞培養(yǎng)的上清中獲得了類病毒顆粒VLPs，為后續(xù)的外源蛋白影響VLPs形成的機(jī)制及其納米顆粒的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。單獨(dú)利用HCV的Core蛋白獲得HCV的類病毒顆粒，這為HCV形態(tài)發(fā)生、病毒與宿主細(xì)胞的相互作用以及尋找病毒組裝的抑制子提供了思路;同時(shí)這也為納米藥物的設(shè)計(jì)提供了新的途徑和平臺(tái)。

1 Miller RH，Purcell RH.Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1990;87(6):2057-61.

2 Choo QL，Kuo G，Weiner A，et al.Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome〔J〕.Science，1989;244(1):359-62.

3 Yamada N，Tanihara K，Takada A，et al.Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus〔J〕.Virology，1996;223(1):255-61.

4 Kato N，Hijikata M，Oot suyama Y.Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non2A，non2B hepatitis〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1990;87(24):9524-8.

5 Takamizawa A，Mori C，F(xiàn)uke I，et al.Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers〔J〕.J Virol，1991;65(3):1105-13.

6 Li X，Jeffers LJ，Shao L，et al.Identification of hepatitis C virus by immunoelectron microscopy〔J〕.J Viral Hepat，1995;2(5):227-34.

7 Kaito M，Watanabe S，Tsukiyama-Kohara K，et al.Hepatitis C virus particle detected by immunoelectron microscopic study〔J〕.J Gen Virol，1994;75(7):1755-60.

8 Prince AM，Huima-Byron T，Parker TS，et al.Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins〔J〕.J Viral Hepat，1996;3(1):11-7.

9 Saito I，Miyamura T，Ohbayashi A.Hepatitis C virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1990;87(17):65472-549.

10 Harro CD，Pang YY，Roden RB，et al.Safety and immunogenicity trial in adult volunteers of a human papillomavirus 16 L1 virus-like particle vaccine〔J〕.J Natl Cancer Inst，2001;93(4):284-92.

11 Koutsky LA，Ault KA，Wheeler CM，et al.A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine〔J〕.N Engl J Med，2002;347(21):1645-51.

12 Takuya Shishido，Masaru Muraoka，Masakazu Ueda，et al.Secretory production system of bionanocapsules using a stably transfected insect cell line〔J〕.Appl Microbiol Biotechnol，2006;73(3):505-11.

13 Dongwei Yu，Chie Aman，Takayuki Fukuda，et al.The specific deliveryof proteins to human liver cells by engineered bio-nanocapsules〔J〕.FEBS，2005;272(14):3651-60.

14 Baumert TF，Ito S，Wong DT.Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus like particles in insect cells〔J〕.J Virol，1998;72(5):3827-36.

15 Falcon V，Acosta-Rivero N，Chinea G.Ultrastructural evidences of HCV infection in hepatocytes of chronically HCV infected patients〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2003;305(4):1085-90.

16 Malika Ait-Goughoulte，Christophe Hourioux，Romuald Patient，et al.Core protein cleavage by signal peptide peptidase is required for hepatitis C virus-like particle assembly〔J〕.J Gen Virol，2006;87(4):855-60.

〔2011-12-13收稿 2012-03-12修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

Q7

A

1005-9202(2012)21-4700-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.21.042

浙江省自然科學(xué)基金(No.Y208676)

呂建新(1963-)，男，博士，教授，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷和分子診斷技術(shù)研究。

李 祥(1978-)，男，博士，副教授，主要從事分子病毒學(xué)研究。