劉學(xué)軍，楊良豐，史 璐，任延方，岳陽麗，吉雅麗，王慶端

(1.鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450052;2.美國羅切斯特大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院，羅徹斯特14627;3.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052)

三氧化礦物凝聚體(mineral trioxide aggregate，MTA)是廣泛應(yīng)用于臨床的一種新型生物材料，可用于活髓切斷、髓室底穿孔修補、根尖誘導(dǎo)形成和根尖倒充填等多個治療領(lǐng)域，并取得了令人滿意的治療效果［1－2］，雖然大量臨床研究報道了關(guān)于MTA的療效，但其作用機制迄今尚不明確。

Takita等［3］研究發(fā)現(xiàn)，MTA能促進成人牙髓細胞增殖和分化。Paranjpe等［4］研究發(fā)現(xiàn)，MTA能誘導(dǎo)牙髓細胞向成牙本質(zhì)細胞分化。但是在上述研究中并沒有明確指出MTA是對牙髓組織中的何種細胞發(fā)生作用的，考慮到牙髓組織中的成牙本質(zhì)細胞和成纖維細胞均屬于終末細胞，而牙髓干細胞是存在于牙髓組織中且具有多向分化潛能的干細胞［5］，因而推測MTA可能作用于牙髓組織中的牙髓干細胞。有鑒于此，本研究擬通過體外培養(yǎng)成人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)，觀察不同濃度MTA對其增殖和分化的影響以驗證這種推測，同時初步探討MTA作用機制。

1 材料和方法

1.1 牙髓干細胞的培養(yǎng)

取第4代hDPSCs(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈)用含100 mL/L胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的α－MEM(Hyclone，美國)培養(yǎng)基在37℃標準環(huán)境下進行培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長到80% ～90%時，用胰蛋白酶消化，以1×104/mL的密度接種進行傳代培養(yǎng)。

1.2 MTA浸提液的制備

參照 Hakki等［6］的方法，取 0.4 g MTA(Dentsply，美國)加入20 mL無胎牛血清的α－MEM培養(yǎng)液，在恒溫振蕩器內(nèi)37℃，200 r/min振蕩24 h后，2 000 r/min離心 5 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾除菌，即制成 20 mg/mL MTA 浸提液，然后再用α－MEM分別稀釋成2 mg/mL和0.2 mg/mL;同時同法制備2 mg/mL的Ca(OH)2浸提液，分別4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同濃度MTA對hDPSCs增殖影響的觀察

取生長良好的第5代hDPSCs，以1×104/mL的細胞密度接種于5塊96孔板，加入含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，37℃標準環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)液，并將細胞隨機分為5組(1個空白對照組，1個陽性對照組和3個實驗組)，每組復(fù)6孔。3個實驗組分別加入終末濃度為 20、2、0.2 mg/mL的MTA浸提液;陽性對照組加入終末濃度為2 mg/mL的Ca(OH)2浸提液;空白對照組加入含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后2、4、6、8 d取各組細胞，參照Kai等［7］的方法，采用MTT法在Model 680酶標儀(BIORAD，美國)上測定各組各孔490 nm波長下的吸光度(OD)值(參考波長為630 nm)。

1.4 不同濃度MTA對hDPSCs分化的影響

1.4.1 不同濃度MTA作用下hDPSCs礦化能力觀察

取生長良好的第5代牙髓干細胞以1×104/mL的密度接種于6孔板，按上述1.3的方法隨機分為5組并分別加入相應(yīng)的浸提液，連續(xù)培養(yǎng)28 d。參照O h SA［8］的方法進行Von Kossa染色，熒光顯微鏡觀察并攝片。

1.4.2 不同濃度MTA作用下hDPSCs堿性磷酸酶(ALP)活性觀察

取生長良好的第5代牙髓干細胞以1×104/mL的濃度接種于96孔板，按上述1.3的方法隨機分為5組并分別加入相應(yīng)的浸提液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、9、12 d取各組細胞，按照堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京生物工程研究所)說明，在Model 680酶標儀上測定各組各孔520 nm波長下的吸光度(OD)值(參考波長為630 nm)。

1.4.3 RT－PCR 檢測牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)基因的表達

取第5代牙髓干細胞以1×104/mL接種于6孔板，并隨機分為3組(2個實驗組和1個空白對照組)，2個實驗組分別加入終末濃度為2、0.2 mg/mL的MTA浸提液，空白對照組加入含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞生長到80% ～90%時收集細胞，按照 RNAiso Plus(Total RNA提取)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明提取總RNA，測定純度后按Prime-Script?RT－PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明合成cDNA;運用Primer 5引物設(shè)計軟件，以DSPP、GAPDH為內(nèi)參設(shè)計引物，經(jīng)Blast軟件比對引物特異性后由大連寶生物工程有限公司合成引物。各組引物序列如下。

DSPP上游引物:5'－GGGACACAGGAAAAGCAGAA－3'，下游引物:5'－TGCTCCATTCCCACTAGGAC－3'，產(chǎn)物大小98 bp;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5'－GAAGGTGAAGGTCGGAGT－3'，下游引物:5'－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3'，產(chǎn)物大小326 bp。然后按照 Prime-Script? RT－PCR試劑盒(TaKaRa，日本)說明書進行RT－PCR，反應(yīng)體系分別為:10×PCR BufferⅡ5 μL，dNTP Mixture 2 μL，Primer－F 0.5 μL，Primer－R 0.5 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液 1 μL，Rnase Free dH2O 加至 50 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸6 min。RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)終瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)(Kodak，美國)成像并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MTA浸提液對hDPSCs增殖的影響

MTA濃度為20 mg/mL時，除培養(yǎng)2 d外，其他時間點的OD值均明顯低于其他各實驗組及空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);各時間點雖稍高于陽性對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。MTA 濃度為 2 mg/mL 和 0.2 mg/mL 時，2、4、6、8 d各時間點的OD值均明顯高于空白對照組和陽性對照組(P ＜0.05)，其中以 2 mg/mL 組最高，與0.2 mg/mL 組相比有顯著差異(P ＜0.05)(表1)。

2.2 Von Kossa染色結(jié)果

hDPSCs培養(yǎng)28 d，2 mg/mL MTA組Von Kossa染色陽性并可見鈣化結(jié)節(jié)(圖1a、b)，其他各組Von Kossa 染色均呈陰性(圖 1a、c、d、e)，且20 mg/mL MTA組的hDPSCs分解成碎片(圖1a)。

表1 不同濃度MTA浸提液對hDPSCs增殖的影響(ODs)

表1 不同濃度MTA浸提液對hDPSCs增殖的影響(ODs)

不同字母為同一時間點內(nèi)各組相比P＜0.05

2 d 4 d 6 d 8 d 20 mg/mL MTA 0.025 ±0.0055ac 0.2072 ±0.076a 0.0203 ± 0.003a 0.0363 ±0.036組別a 2 mg/mL MTA 0.0322 ±0.0119bc 0.5905 ±0.147b 0.7185 ± 0.050b 0.8688 ±0.049b 0.2 mg/mL MTA 0.0285 ±0.0036bc 0.4098 ±0.109c 0.5117 ± 0.033c 0.6658 ±0.050c陽性對照組 0.0152 ±0.0033a 0.1745 ±0.035a 0.0200 ±0.002a 0.0271 ±0.007a空白對照組 0.0152 ±0.0056a 0.3031 ±0.062d 0.4129 ±0.053d 0.4848 ±0.052d

圖1 hDPSCs培養(yǎng)28 d后Von Kossa染色(×20)

2.3 堿性磷酸酶活性測定

培養(yǎng)6、9、12 d各時間20 mg/mL MTA浸提液組hDPSCs的ALP活性均明顯低于其他實驗組和空白對照組(P＜0.05)，而與陽性對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。2 mg/mL 和0.2 mg/mL MTA浸提液組hDPSCs的ALP活性均明顯高于其他各組(P ＜0.05)，其 中 以 2 mg/mL 組 最 高，其 與0.2 mg/mL組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)(表2)。

表2 不同濃度MTA對hDPSCs ALP活性的影響(ODs)

表2 不同濃度MTA對hDPSCs ALP活性的影響(ODs)

不同字母為同一時間點各組相比P＜0.05

6 d 9 d 12 d 20 mg/mL MTA浸提液組 0.0302 ±0.0057a 0.047 ±0.0191a 0.0679 ±0.0301a組別2 mg/mL MTA 浸提液組 0.0978 ±0.0144b 0.2807 ±0.0281b 0.3907 ±0.0520b 0.2 mg/mL MTA 浸提液組 0.0697 ±0.0165c 0.1038 ±0.0179c 0.2088 ±0.0422c陽性對照組 0.0320 ±0.0062a 0.0488 ±0.0125a 0.0610 ±0.0221a空白對照組 0.0533 ±0.0143d 0.0723 ±0.0297d 0.1048 ±0.0275d

2.4 RT－PCR檢測DSPP基因的表達

2、0.2 mg/mL MTA浸提液組和空白對照組均出現(xiàn)DSPP基因條帶，其中2 mg/mL組條帶亮度最強，其大小約98 bp，符合引物設(shè)計要求(圖2)。

圖2 DSPP基因電泳圖

3 討論

MTA因其良好的生物相容性和封閉性已在牙體牙髓及根尖周病治療中廣泛應(yīng)用，并顯示出良好的封閉、消毒、礦化及促進牙本質(zhì)牙槽骨形成的效果［9－10］。此前雖針對MTA及同類產(chǎn)品展開了如理化特性、組織生物相容性、細胞反應(yīng)、生理效應(yīng)等有許多研究和報道，但截至目前為止，關(guān)于MTA的作用機制尚不明確。因此本實驗通過觀察不同濃度的MTA對牙髓干細胞增殖和分化的影響，以期探討MTA的作用機制。

根據(jù)產(chǎn)品所提供的粉液比例(1 g/0.35 mL)，本實驗選擇了與其相近的實驗濃度及相差的兩組濃度梯度即:2、20、0.2 mg/mL的 MTA 浸提掖與hDPSCS共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示，2 mg/mL MTA組的吸光度值明顯高于其他各組，說明適宜濃度的MTA對hDPSCs的生長增殖具有促進作用，這可能主要是由于與氫氧化鈣等相比，MTA具有相對較低的基礎(chǔ)滴度［11］，從而具有較好的細胞相容性;而20 mg/mL MTA組hDPSCs的吸光度值明顯低于空白對照組及其他實驗組，表明高濃度的MTA對hDPSCs的增殖具有抑制作用，推測其原因可能與20 mg/mL MTA浸提液具有較高pH值(8.63)有關(guān)，但具體原因需進一步研究證實。該結(jié)果與趙秀等［12］研究結(jié)果基本一致。

本實驗以Von Kossa染色檢測組織中鈣鹽形成及礦化。結(jié)果顯示:2 mg/mL MTA組培養(yǎng)hDPSCs 28 d后可見Von Kossa染色陽性的鈣化結(jié)節(jié)，其他各組均為陰性，而20 mg/mL MTA組可見細胞裂解碎片，表明適宜濃度的MTA可誘導(dǎo)hDPSCs的分化及礦化。Ca(OH)2組未見明顯礦化產(chǎn)生。Ali等［13］用 MTA 和 Dycal? ［一種 Ca(OH)2制劑，Densply，美國］進行直接蓋髓的動物實驗，30 d后發(fā)現(xiàn)MTA組牙齒形成鈣化橋的比率遠高于Dycal組。體外實驗也證實，MTA可刺激成骨細胞的分化并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)蛋白形成礦化基質(zhì)，從而誘導(dǎo)體外礦化過程［14］。

ALP是骨形成所必須的酶，ALP的表達代表著骨形成的狀況，表明細胞分化的開始，并隨著細胞分化的發(fā)展而增強，因此本實驗以ALP作為牙髓干細胞分化的指標。結(jié)果顯示:各實驗組從6 d開始可檢測到ALP活性，從9 d開始2 mg/mL MTA組hDPSCs表達的ALP活性快速升高，明顯高于其他各組，之后緩慢升高，0.2 mg/mL MTA組雖然也有明顯升高，但明顯低于2 mg/mL MTA組，而20 mg/mL MTA組hDPSCs表達ALP活性明顯低于空白對照組，說明適宜濃度的MTA可誘導(dǎo)hDPSCs的分化與礦化，且該分化過程出現(xiàn)在細胞生長的較早期階段，而此前細胞處在增殖、生物合成細胞外基質(zhì)進而出現(xiàn)細胞分化的過程，而隨著基質(zhì)的成熟，ALP的活性就逐漸表現(xiàn)出來。本實驗中ALP陽性高表達的時間(9d)與 Kyung等［15］(2009)的研究結(jié)果(1 d)有所不同，可能是由于細胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基等的差異所致;Mori等［16］研究也發(fā)現(xiàn)牙髓干細胞向成骨細胞分化時，成骨培養(yǎng)基可更好的誘導(dǎo)其表達ALP。

DSPP在牙本質(zhì)形成和礦化的過程中起著重要的調(diào)控作用，在牙齒發(fā)育過程中，成牙本質(zhì)細胞持續(xù)表達DSPP，因此DSPP被作為成牙本質(zhì)細胞分化的特異性標記蛋白。因為在上述實驗中，只有2 mg/mL及0.2 mg/mL MTA組表現(xiàn)出 hDPSCs的增殖及分化活性，因此本實驗中選取該兩組進行檢測。結(jié)果2 mg/mL MTA組在7 d出現(xiàn)DSPP目的基因條帶，大小約98 bp，且條帶的亮度明顯高于其他兩組，這與Lee等［17］研究結(jié)果一致，提示適宜濃度的MTA可誘導(dǎo)牙髓干細胞向成牙本質(zhì)細胞方向分化。

本研究通過檢測不同濃度的MTA對hDPSCs生長、分化、增殖及礦化過程的影響，表明適宜濃度的MTA(2 mg/mL)可促進hDPSCs的增殖，并可誘導(dǎo)hDPSCs向成牙本質(zhì)細胞分化及礦化;高濃度的MTA(20 mg/mL)則抑制hDPSCs的增殖，并抑制其向成牙本質(zhì)細胞分化，同時說明MTA具有良好的組織、細胞相容性。

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