郭春蘭，張露

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

油茶SOD基因片段克隆及序列分析

郭春蘭，張露

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與藝術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

根據(jù)已報道的多種植物Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列的保守區(qū)域分別設(shè)計簡并引物，以油茶（Camelliaoleifera）葉片總RNA為模板，通過RT-PCR分別擴(kuò)增得到一個375bp的Cu/Zn-SOD基因片段和一個429bp的Mn/Fe-SOD基因片段。將片段序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對，表明本研究克隆的結(jié)果均與多種植物的Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因存在親緣關(guān)系，因而認(rèn)為所克隆的基因片段就是油茶SOD基因；并運(yùn)用DNAStar5.0軟件分別進(jìn)行序列分析，推導(dǎo)的氨基酸序列分別為125個殘基和143個殘基；具有所有植物SOD基因共有的保守區(qū)域；與多種植物Cu/Zn-SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均分別在80%和84%以上，與其他植物的Mn/Fe-SOD基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在84%和86%以上。

油茶；SOD；基因克?。恍蛄蟹治?/p>

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）是一個金屬酶家族，具有清除生物體代謝所產(chǎn)生的超氧自由基的特異性，能夠有效防止生物分子被氧化。SOD廣泛存在于各種生物體內(nèi)，是生物執(zhí)行體防御機(jī)能最重要的酶之一［1］。SOD根據(jù)其酶活性中心輔基結(jié)合金屬離子的不同，分為Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD。自20世紀(jì)80年代從玉米（Zea mays）［2］中克隆了首個植物SOD基因至今，國內(nèi)外學(xué)者已從蓮（Nelumbonucifera）［3］、丹參（Salvia miltiorrhiza）［4］、甘薯（Caricapapaya）［5］、萵苣（Lactucadolichophylla）［6］等多種植物中克隆出SOD基因。

油茶（Camelliaoleifera）是山茶科山茶屬植物，為我國特有的食用油料樹種，其綜合利用價值極高，具有良好的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會效益，在我國林業(yè)，尤其是江西省林業(yè)中占有十分重要的地位［7-8］。由于油茶病蟲害種類繁多，主要有炭疽病、軟腐病、煙煤病、油茶葉蜂、油茶蛀莖蟲等，傳統(tǒng)防治方法效果不佳［9-10］。而近年來，油茶基因工程研究主要集中在與油脂合成有關(guān)的關(guān)鍵酶基因方面［11-13］，與油茶抗逆分子研究的相關(guān)報道較少。因此，從分子水平對油茶的抗逆性進(jìn)行研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以油茶為材料，以克隆SOD基因的核心序列為目標(biāo)，克隆其全長序列，研究該基因時空特異性表達(dá)，為探索其調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 于2011年3月，從江西省林業(yè)科學(xué)院油茶種質(zhì)資源圃采集油茶優(yōu)良品種——贛無1號的幼嫩葉片，用液氮速凍后，放入-80℃的超低溫冰箱中備用。

克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物公司，受體大腸桿菌（Escherichiacoli）菌株為JM109，限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶等購自大連寶生物公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Clontech公司，dNTPs、氨芐青霉素、DNA marker等購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 使用改良異硫氰酸胍法提取油茶葉片總RNA。

1）對試驗(yàn)所用的金屬、玻璃和塑料制品進(jìn)行去RNA酶（RNase）處理：用0.1%DEPC水浸泡槍頭和離心管12h以上，之后，高溫高壓滅菌，烘干后備用；金屬和玻璃器具直接放入170℃烘箱內(nèi)連續(xù)烘烤12h以上。提取RNA所用藥品均為RNA專用；2）取0.5g葉片，加液氮于研缽中研磨成粉末，將其轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的10mL離心管中，加入異硫氰酸胍提取緩沖液3mL、β-巰基乙醇200μL、4%可溶性PVP（W/W），劇烈搖勻；3）按順序依次加入2 mol·L-1醋酸鈉0.5mL，水飽和酚3mL，氯仿/異戊醇（24∶1）1mL，劇烈搖勻，在冰上放置20min；4）4℃，10 000r·min-1，離心20min，轉(zhuǎn)上清液至一新10mL離心管中；5）加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），搖勻；6）轉(zhuǎn)上清液至一新管，加入等體積異丙醇，-20℃下放置1h；7）4℃，10 000r·min-1離心20min，去上清，加入1.5mL異硫氰酸胍提取緩沖液和等體積異丙醇，混勻，-20℃下放置1h；8）4℃，10 000r·min-1，離心20min，去上清，用70%乙醇洗2次沉淀；9）把離心管置超凈工作臺上適當(dāng)晾干，加適量DEPC處理水溶解沉淀；10）電泳、紫外分光光度計檢測，分裝，于-70℃冰箱中保存。

1.2.2 簡并引物設(shè)計 參照GenBank所報道的番木瓜（Caricapapaya）［14］、楊樹（Populustremula）［15］、檸檬、棉花（Gossypiumspp.）［16］等植物的Cu/Zn-SOD基因氨基酸的保守序列，設(shè)計一對簡并引物。正向引物YCZ1序列：5′-GGWCCNACMACTGTDACTGGA-3′，反向引物序列YCZ2：5′-AARTCCAAYAARACCACAAGC-3′。

參照GenBank所報道的山茶、煙草［17］、洋橄欖［18］、擬南芥等植物的Mn/Fe-SOD基因氨基酸的保守序列，設(shè)計一對簡并引物。正向引物YMF1序列：5′-CAGAARCAYCAYCARACNTAYGT-3′，反向引物序列YMF2：5′-RTARTANGCRTGYTCCCA-3′。所設(shè)計引物由Invitrogen公司合成。

1.2.3 總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 參照Invitrogen公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成第一鏈cDNA。

1.2.4 油茶Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因片段克隆 Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因片段克隆PCR反應(yīng)體系均為50μL，包括10×Reaction buffer 5μL、Mg2+3.75μL、dNTPs（2.5mmol·L-1）4.5μL、正向引物（10μmol·L-1）1μL、反向引物（10μmol·L-1）1μL、cDNA 7.5μL、TaqDNA聚合酶（5U·μL-1）0.75μL、ddH2O 26.5μL。Cu/Zn-SOD基因克隆的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，94℃1min，45℃1min，72℃1min，擴(kuò)增35個循環(huán)后，72℃10min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物；Mn/Fe-SOD基因克隆的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，94℃1min，40℃1min，72℃1min，擴(kuò)增35個循環(huán)后，72℃10min，4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳后，切下目的片段，經(jīng)回收純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，然后隨機(jī)挑選經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切確認(rèn)的重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程公司測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上通過Blast n和Blast p進(jìn)行序列的相似性分析，用DAMBE生物軟件進(jìn)行序列的比較分析。

2 結(jié)果

2.1 總RNA完整性檢測 用紫外分光光度法測定油茶葉片總RNA的OD260/OD280和OD260/OD230比值，其中OD260/OD280=1.92，OD260/OD230= 2.05，電泳檢測結(jié)果顯示，28srRNA的亮度約為18srRNA的2倍（圖1），說明提取的總RNA純度高而且完整性好。

圖1 油茶葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖Fig.1 The electrophoretic result of total RNAextraction inCamelliaoleifera’s leaf

2.2 PCR產(chǎn)物的分析 以cDNA為模板和已報道的多種植物的Cu/Zn-SOD、Mn/Fe-SOD基因序列設(shè)計的簡并引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別得到一條375和429bp的特異性條帶（圖2），命名為YCZ和YMF，經(jīng)過雙酶切鑒定后，證明YCZ和YMF均為所要克隆的目的基因片段（圖3）。

2.3 序列分析和同源性比較

2.3.1 測序結(jié)果分析 序列分析結(jié)果表明，片段YCZ的cDNA序列長度為3 7 5bp，編碼1 2 5個氨基酸；片段YMF的cDNA序列長度為429bp，編碼143個氨基酸?？寺∷眯蛄芯殉晒μ峤籊en-Bank，登錄號分別為JN616272和JN616273。

圖2 油茶Cu/Zn-SOD和Mn/Fe-SOD基因片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 PCR products of Cu/Zn-SOD and Mn/Fe-SOD gene fragments inCamelliaoleifera

2.3.2 序列同源性分析 序列同源性分析結(jié)果（表1）表明，油茶Cu/Zn-SOD基因的核苷酸序列與其他多種植物的Cu/Zn-SOD基因核苷酸序列同源性較高，如與山茶、檸檬、陸地棉、車前、橡膠、楊梅、大黃、油菜、五色梅和擬南芥的同源性分別為92.5%、86.7%、86.1%、85.9%、85.9%、85.3%、82.9%、81.9%、81.3%和80.8%，與山茶科山茶屬植物山茶的同源性高達(dá)92.5%，說明本試驗(yàn)所得序列正是油茶Cu/Zn-SOD基因的部分序列。使用DAMBE生物統(tǒng)計軟件把克隆所得的油茶Cu/Zn-SOD基因的氨基酸序列與上述植物相比較，同源性均大于84%。比較結(jié)果表明，山茶科植物的Cu/Zn-SOD基因核苷酸序列在進(jìn)化過程中變異幅度非常小。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切電泳檢測結(jié)果Fig.3 Detection by EcoRⅠand PstⅠdigestion for recombinant plasmid

表1 試驗(yàn)所得序列與其他植物Cu/Zn-SOD基因的核苷酸序列同源性比較Table 1 Sequences of cloning identity to other species of Cu/Zn-SOD gene

序列同源性分析結(jié)果（表2）表明，油茶Mn/Fe-SOD基因的核苷酸序列與其他多種植物的Mn/Fe-SOD基因核苷酸序列同源性較高，如與山茶、龍眼、金柑、三葉膠、桃、洋橄欖、五色梅、飛龍枳、番薯和煙草的同源性分別為92.5%、88.1%、86.3%、86.2%、86.0%、85.8%、84.8%、84.5%、84.4%和84.1%，與山茶科山茶屬植物山茶的同源性高達(dá)92.5%，說明本試驗(yàn)所得序列正是油茶Mn/Fe-SOD基因的部分序列。使用DAMBE生物統(tǒng)計軟件把克隆所得的油茶Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列與上述多種植物相比較，同源性均大于86%。比較結(jié)果表明，Mn/Fe-SOD的保守程度較高。

表2 試驗(yàn)所得序列與其他植物Mn/Fe-SOD基因的核苷酸序列同源性比較Table 2 Sequences of cloning identity to other species of Mn/Fe-SOD gene

3 討論

SOD根據(jù)其酶活性中心輔基結(jié)合金屬離子的不同，分為Cu/Zn-SOD、Mn/Fe-SOD和Fe-SOD。Cu/Zn-SOD基因與Mn/Fe-SOD基因、Fe-SOD基因分別來源于不同的祖先，而Mn-SOD基因和Fe-SOD基因來源于共同的祖先。陳淮楊和劉望夷［19］研究認(rèn)為，Cu/Zn-SOD基因保守程度非常高，適合作為研究基因進(jìn)化和物種分類的指標(biāo)基因，但本研究克隆獲得的油茶Mn/Fe-SOD基因片段與其他植物Mn/Fe-SOD基因核苷酸和氨基酸同源性在84.1%和86.0%以上，而油茶Cu/Zn-SOD基因片段與其他植物Cu/Zn-SOD基因核苷酸和氨基酸同源性在80.8%和81.6%以上，分析數(shù)據(jù)顯示，油茶Mn/Fe-SOD基因較Cu/Zn-SOD基因更為保守。因此，是否可以用Mn/Fe-SOD基因替代Cu/Zn-SOD基因，作為研究油茶基因進(jìn)化和品種分類指標(biāo)基因，值得通過相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

植物細(xì)胞在正常代謝活動和逆境條件下均能產(chǎn)生活性氧，而SOD是清除植物體內(nèi)活性氧的重要抗氧化酶之一。在逆境條件下，植物的抗性與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性水平密切相關(guān)。隨著鹽堿濃度的增大，紫花苜蓿（Medicagomativa）葉片SOD含量增加趨勢顯著［20］；自然降溫下，狗牙根（Cynodondactylon）SOD活性隨著溫度的降低，呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢［21］；在整個越冬期，高羊茅（Fesuca leata）SOD活性也呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢［22］。導(dǎo)致植物體內(nèi)SOD活性高低的直接原因可能是SOD基因在植物體內(nèi)的表達(dá)差異。因此，需要從基因水平研究SOD基因在油茶體內(nèi)表達(dá)差異，從本質(zhì)上闡明油茶抗逆性。

［1］Ma X J，Zhu D H.Functional roles of the plant superoxide dismutase［J］.Hereditas，2003，25（2）：225-231.

［2］Baum J A，Scandalios J G.Multiple genes controlling superoxide dismutase expression in maize［J］.Journal of Heredity，1982，73（2）：95-100.

［3］朱虹琳，董臣，刁英，等.蓮銅鋅超氧化物歧化酶cDNA的克隆和序列分析［J］.武漢大學(xué)學(xué)報，2006，52（4）：475-480.

［4］紀(jì)硯耘，化文平，王喆之.丹參銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因的克隆與生物信息學(xué)分析［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報，2011，39（3）：56-61.

［5］黃明.甘薯葉片超氧化物歧化酶基因克隆及測序［J］.廣西植物，1998，18（2）：165-168.

［6］Ruiz-Lozano J M，Collados C，Barea J M，etal.Cloning of cDNAs encoding SODs from lettuce plants which show differential regulation by arbuscular mycorrhizal symbiosis and by drought stress［J］.Journal of Experimental Botany，2001，52（364）：2241-2242.

［7］莊瑞林.中國油茶［M］.第二版.北京：中國林業(yè)出版社，2008.

［8］龍忠于，王玉娟，陳永忠，等.江西省油茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展綜述［J］.湖南林業(yè)科技，2008，35（3）：56-57.

［9］周國英，宋光桃，李河.油茶病蟲害防治現(xiàn)狀及應(yīng)對措施［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2007，27（6）：179-182.

［10］季冬明.油茶無公害栽培的有害生物防治技術(shù)［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2006，12（5）：20-24.

［11］張黨權(quán)，譚曉風(fēng)，謝祿山，等.油茶EST文庫中不飽和脂肪酸合成關(guān)鍵酶基因的序列分析［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2007，25（2）：5-8.

［12］譚曉風(fēng)，陳鴻鵬，張黨權(quán)，等.油茶FAD2基因全長cDNA克隆及序列分析［J］.林業(yè)科學(xué)，2008，44（3）：16-21.

［13］張黨權(quán)，譚曉風(fēng)，陳鴻鵬.油茶油脂的生物合成及調(diào)控基因的特性［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2007，27（5）：106-111.

［14］Lin M T，KuoT J，Lin C T.Molecular cloning of a cDNA encoding copper/zinc superoxide dismutase from papaya fruit and overexpression inEscherichiacoli［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46（1）：344-348.

［15］Akkapeddi A S，Shin D I，Stanek M T，etal.cDNA and derived amino acid sequence of the chloroplastic copper/zinc-superoxide dismutase form aspen（Poplulustremuloides）［J］.Plant Physiology，1994，106：1231-1232.

［16］Hu G H，Yu S X，F(xiàn)an S L，etal.Cloning and expression of the chloroplast copper/zinc-superoxide dismutase gene in upland cotton（GossypiumhirsutumL.）［J］.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology，2007，33（3）：197-204.

［17］高健，許曉風(fēng)，陳學(xué)平.特異種質(zhì)煙草HZNH的Fe-SOD基因的克隆與表達(dá)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21（6）：840-845.

［18］Francisco J C，Ana F O，Alfonso C，etal.The expression of different superoxide dismutase forms is celltype dependent in olive（OleaeuropaeaL.）leaves［J］.Plant and Cell Physiology，2006，47（7）：984-994.

［19］陳淮楊，劉望夷.從超氧化物歧化酶的分布和結(jié)構(gòu)看其分子進(jìn)化［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1996，23（5）：408-415.

［20］張永峰，殷波.混合鹽脅迫對苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響［J］.草業(yè)學(xué)報，2009，18（1）：46-50.

［21］李秋麗，包滿珠，王文恩.自然降溫下4個狗牙根品種（系）的生理指標(biāo)比較［J］.草業(yè)科學(xué)，2011，28（3）：404-409.

［22］潘冷，樊瑞萍，周琴，等.高羊茅越冬期葉片不同部位生理生化特性研究［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27（7）：5-9.

Cloning and sequence analysis of SOD gene of Camellia oleifera

GUO Chun-lan，ZHANG Lu
（College of Landscape and Art，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

Two pairs of degenerate primers were designed based on the conservative regions in amino acids of Cu/Zn-SOD and Mn/Fe-SOD genes from other plants，respectively.Cu/Zn-SOD gene fragment and Mn/Fe-SOD gene fragment ofCamelliaoleiferawere cloned.Their sizes were 375bp and 429bp，respectively.By using the program of BLAST on NCBI GenBank database，two sequences presented a very high identity with Cu/Zn-SOD and Mn/Fe-SOD genes from other plants.The nucleotide sequences were analyzed by using program of DNAStar 5.0.125amino acids and 143amino acids were coded by the nucleotide sequences and the nucleotide sequences had the same conservative regions of Cu/Zn-SOD and Mn/Fe-SOD genes as many kinds of other plants.The homology comparison of nucleotide sequences of Cu/Zn-SOD gene and Mn/Fe-SOD gene showed the similarities of more than 80%and 84%to other plants，respectively.The similarities of amino acid sequences of Cu/Zn-SOD and Mn/Fe-SOD genes were more than 84%and 86%to other plants.

Camelliaoleifera；SOD；gene cloning；sequences analysis

ZHANG Lu E-mail：zhlu＠163.com

S794.9；Q943.2

A

1001-0629（2012）03-0417-05

2011-10-16 接受日期：2011-12-02

國家科技部“十一五”科技支撐項(xiàng)目（2009BADB1B05-03）

郭春蘭（1979-），女，江西泰和人，講師，在讀博士生，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：lan151＠126.com

張露 E-mail：zhlu＠163.com