任小巍，王瑜，袁慶華

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

正交設(shè)計(jì)優(yōu)化草地早熟禾SRAP-PCR反應(yīng)體系及引物篩選

任小巍1，2，王瑜2，袁慶華2

（1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對(duì)草地早熟禾（Poapratensis）基因組DNA SRAP-PCR反應(yīng)體系中的Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素的用量進(jìn)行優(yōu)化，并比較不同模板DNA用量對(duì)擴(kuò)增的影響，建立草地早熟禾SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，同時(shí)，利用該體系對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，草地早熟禾SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系為T(mén)aq DNA聚合酶1.0U、Mg2+1.75mmol·L-1、引物0.25μmol·L-1、dNTP 220μmol·L-1、40ng模板DNA、2μL 10×PCR buffer，總體積20μL。運(yùn)用該體系從100對(duì)SRAP引物中篩選出43對(duì)引物能夠產(chǎn)生清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶且多態(tài)性豐富。優(yōu)化體系的建立及引物的篩選可為今后利用SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)草地早熟禾進(jìn)行遺傳多樣性分析、圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

草地早熟禾；SRAP標(biāo)記；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；引物篩選

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related Amplified Polymorphism，簡(jiǎn)稱SRAP），是2001年由Li和Quiros［1］在蕓薹屬（Brassica）中首次應(yīng)用的一種基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，該標(biāo)記針對(duì)基因啟動(dòng)子與內(nèi)含子中胸腺嘧啶、腺嘌呤含量豐富而外顯子中胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤含量豐富的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特定引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因不同個(gè)體啟動(dòng)子、內(nèi)含子與間隔區(qū)長(zhǎng)度不同而使擴(kuò)增條帶產(chǎn)生多態(tài)性。SRAP標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率中等以及在基因組中分布均勻等特點(diǎn)［2-3］，已被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源遺傳多樣性分析［4-5］、遺傳圖譜構(gòu)建［6-7］、比較基因組學(xué)［8］、重要性狀基因標(biāo)記［9-10］等方面。

草地早熟禾（Poapratensis）為冷季型草坪草，具有綠期長(zhǎng)、色澤翠綠、質(zhì)地均一柔軟等優(yōu)點(diǎn)，在全世界溫帶地區(qū)廣泛種植［11-13］。目前，ISSR［14］、RAPD［15-16］分子標(biāo)記技術(shù)在草地早熟禾研究中均有應(yīng)用，而SRAP標(biāo)記方面的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次利用正交設(shè)計(jì)，對(duì)草地早熟禾SRAPPCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并利用所得最佳反應(yīng)體系對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，以獲得草地早熟禾最佳SRAPPCR反應(yīng)體系和多態(tài)性豐富的SRAP引物組合，以期為草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)所用的4份草地早熟禾材料（表1）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草種質(zhì)資源研究室提供，SRAP-PCR體系優(yōu)化的DNA模板來(lái)自巴林。SRAP引物由上海生工生物工程公司合成，dNTP和Taq DAN聚合酶為T(mén)aKaRa產(chǎn)品。

表1 供試材料的名稱與來(lái)源Table 1 Names and sources of experimental plants

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 以苗期草地早熟禾葉片為材料，采用改進(jìn)的CTAB法［17］提取基因組DNA，通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，并以一定濃度的λDNA作為定量參照標(biāo)準(zhǔn)，稀釋樣品DNA濃度至50ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP進(jìn)行4因素3水平篩選（表2、表3），所用引物為Me1和Em3組合（表4）。在20μL PCR反應(yīng)體系中，含有2μL 10×PCR buffer和50ng模板DNA，其余各成分含量按表3進(jìn)行制備。

表2 SRAP-PCR體系的因素和水平Table 2 Factors and levels of SRAP-PCR system

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1 min，37℃退火1min，72℃延伸1min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7min，4℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取7.5μL PCR產(chǎn)物與1.5μL 6×Loading buffer混勻，點(diǎn)入含0.5μg·mL-1EB的2%瓊脂糖凝膠中，在100V電壓下電泳60min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于紫外凝膠成像儀中觀察照相。

1.2.3 模板DNA用量?jī)?yōu)化 應(yīng)用正交試驗(yàn)篩選出的最佳組合，對(duì)模板DNA用量進(jìn)行優(yōu)化。引物選用Me1、Em3組合，模板DNA用量設(shè)置12個(gè)梯度，依次為10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80ng。

1.2.4 引物篩選及優(yōu)化體系的應(yīng)用 依據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定的SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系，以巴林基因組DNA為模板，對(duì)供試的100對(duì)引物組合（表4）進(jìn)行篩選；從篩選得來(lái)的引物中隨機(jī)選取6對(duì)引物組合，對(duì)4份草地早熟禾種質(zhì)材料進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證。

表3 SRAP-PCR［L9（34）］正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Orthogonal design of SRAP-PCR［L9（34）］

2 結(jié)果與分析

表4 SRAP引物序列Table 4 Primer sequences of SRAP

2.1 SRAP-PCR正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果分析 依據(jù)譜帶的數(shù)量及強(qiáng)弱，將SRAP-PCR反應(yīng)體系9個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果由好至差依次排列為7、3、4、8、2、5、1、9、6（圖1）。1、2、5、6和9五個(gè)組合條帶數(shù)量過(guò)少，不宜采用；3、4、7、8四個(gè)組合條帶均較多，經(jīng)仔細(xì)比較后發(fā)現(xiàn)組合7的條帶數(shù)量最多且清晰度高。因此，選擇該組合為草地早熟禾SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系，即4因素用量分別為T(mén)aq DNA聚合酶1.0U、Mg2+1.75mmol·L-1、引物0.25μmol·L-1、dNTP 220μmol·L-1，總體積20μL。

圖1 正交設(shè)計(jì)SRAP-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of SRAP-PCR system under orthogonal design

參照張麗等［18］的統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)9個(gè)組合正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（表5），其中K代表該因子在某水平下參與反應(yīng)所擴(kuò)增出的總條帶數(shù)；k代表該因子在某水平下的平均擴(kuò)增條帶數(shù)，即K的平均值，其大小反映了該因子的不同水平對(duì)反應(yīng)體系的影響狀況，k值越大表明該水平越好；R代表不同水平下該因子得到的條帶最大平均值與最小平均值之差，即k的最大值與最小值之差，R值越大，表明該因子對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響越顯著。從k值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看，Taq DNA聚合酶以水平3好，Mg2+以水平3好，引物以水平3好，dNTP以水平1好，即Taq DNA聚合酶1.5U、Mg2+1.75mmol·L-1、引物0.25 μmol·L-1、dNTP 220μmol·L-1，該體系與組合7最接近，僅在Taq DNA聚合酶濃度上略有差異，而直觀分析得出的最佳體系組合也為組合7，從而雙重確認(rèn)組合7為最佳體系組合。由R的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明在被試3個(gè)水平下，Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響由強(qiáng)到弱依次為引物＞Taq DNA聚合酶=dNTP＞Mg2+。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Table 5 Statistic result of orthogonal design

2.2 模板DNA用量的確定 由于模板DNA的用量不同，草地早熟禾SRAP-PCR擴(kuò)增結(jié)果存在較大差異（圖2）：當(dāng)模板DNA用量過(guò)低（≤25ng）或過(guò)高（≥60ng）時(shí)，條帶數(shù)量很少或幾乎無(wú)條帶；當(dāng)模板用量為30～50ng時(shí)條帶數(shù)量多，且清晰穩(wěn)定，各處理間均勻一致，說(shuō)明SRAP擴(kuò)增模板DNA濃度適應(yīng)范圍較寬。此5個(gè)處理基因組DNA用量平均為40ng，而在40ng條件下擴(kuò)增條帶清晰無(wú)雜帶。因此，最終確定20μL體系中模板DNA的含量為40ng。

圖2 不同模板DNA濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results under different template DNA concentration

2.3 SRAP引物篩選及驗(yàn)證 利用優(yōu)化好的SRAP-PCR反應(yīng)體系，對(duì)供試的100對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，有43對(duì)引物能夠產(chǎn)生清晰穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的條帶（表6）。從中隨機(jī)選出6對(duì)（Me1和Em10、Me2和Em1、Me3和Em1、Me5和Em2、Me6和Em9、Me10和Em1）對(duì)4份草地早熟禾進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明（圖3），6對(duì)引物共擴(kuò)增出34條譜帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出5.7條；其中，多態(tài)性譜帶17條，占總數(shù)的50%，每對(duì)引物均擴(kuò)增出了多態(tài)性條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)為2.8條（表7）。由此說(shuō)明，篩選出的43對(duì)SRAP引物能夠產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，可應(yīng)用于草地早熟禾遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記等方面的研究。

3 討論與結(jié)論

表6 篩選出的SRAP引物Table 6 Screened SRAP primer

圖3 優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系在部分引物組合中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of primers in optimized SRAP-PCR system

在PCR反應(yīng)體系中各個(gè)因素間都會(huì)發(fā)生相互作用，如Mg2+受dNTP的拮抗作用，而Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，Mg2+濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)直接影響Taq DNA聚合酶的活性，而Taq DNA聚合酶又是引物與模板DNA結(jié)合后進(jìn)行延伸的必要因素。因此，反應(yīng)體系中任何一種因素的改變都會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果發(fā)生變化［19-22］。與以往的單因素PCR優(yōu)化設(shè)計(jì)相比，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化PCR反應(yīng)體系可以綜合考察各因素及其交互作用，減少工作量，降低試驗(yàn)成本，快速獲得滿意的試驗(yàn)結(jié)果［23-25］。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化草地早熟禾SRAPPCR反應(yīng)體系，并參照張麗等［18］的方法對(duì)各因素不同水平組合的正交結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，得出在本研究中各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響由大到小依次為引物＞Taq DNA聚合酶=dNTP＞Mg2+，而運(yùn)用該方法得出的最佳體系組合與直觀分析得出的最佳體系組合最為接近，肯定了該體系的可行性。

表7 6個(gè)多態(tài)性引物組合的擴(kuò)增結(jié)果Table 7 Amplification results of six polymorphism primer combinations

利用SRAP、AFLP、ISSR三種分子標(biāo)記方法對(duì)毛竹（Phyllostachysheterocycla）種質(zhì)的鑒別表明，SRAP的單一分子標(biāo)記一致性高于AFLP和ISSR兩種標(biāo)記［26］。與RAPD標(biāo)記相比，SRAP聚類分析的石斛屬植物遺傳關(guān)系結(jié)果更接近于基于形態(tài)特征的分類結(jié)果，能更準(zhǔn)確地揭示品種間的地域特性及親緣關(guān)系，而且SRAP標(biāo)記技術(shù)具有更高的標(biāo)記效率［27］。本研究也表明，SRAP標(biāo)記應(yīng)用于草地早熟禾中產(chǎn)生的多態(tài)性豐富，同樣可以對(duì)草地早熟禾優(yōu)良性狀標(biāo)記、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面進(jìn)行更深入的研究。另外，在本研究中，對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)選用了瓊脂糖凝膠電泳，若選用靈敏度更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳，則可以大大提高檢測(cè)的分辨率，多態(tài)性條帶數(shù)量也會(huì)相應(yīng)增多，更利于進(jìn)行深入研究。

本研究應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)草地早熟禾SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終得到的最佳反應(yīng)體系：Taq DNA聚合酶1.0U、Mg2+1.75 mmol·L-1、引物0.25μmol·L-1、dNTP 220 μmol·L-1、40ng模板DNA、2μL 10×PCR buffer，總體積20μL；利用最佳反應(yīng)體系對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，共得到43對(duì)引物能夠產(chǎn)生清晰穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的條帶；從中選取6對(duì)引物對(duì)4份草地早熟禾材料進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，該反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，且各引物能夠產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，可用于草地早熟禾SRAP分子標(biāo)記研究。

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Optimization of SRAP-PCR system on Poa pratensis using orthogonal design and selection of primers

REN Xiao-wei1，2，WANG Yu2，YUAN Qing-hua2
（1.College of Pastoral Agricultural Science and Technology，Lanzhou University，Lanzhou 730020，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100193，China）

An orthogonal design was used to optimize a SRAP-PCR system forPoapratensiswith 4factors（Mg2+，dNTP，primer and Taq polymerase）at 3levels plus the concentration of template DNA.The optimized SRAP-PCR system was：2μL 10×PCR buffer，40ng template DNA，Mg2+1.75mmol·L-1，dNTP 220μmol·L-1，primer 0.25μmol·L-1，Taq DNA polymerase 1.0Uin a total of 20μL reaction mixtures.With the optimized system，43primer combinations were selected among 100primer combinations，which produced abundant polymorphism bands.This study optimized SRAP-PCR system and selected the proper primers inP.pratensis，which would play an important role in genetic diversity analyses，map construction，germplasm identification inP.pratensiswith SRAP markers.

Poapratensis；SRAP markers；orthogonal design；selection of primers

YUAN Qing-hua E-mail：yuanqinghua＠hotmail.com

S688.4；Q945.79

A

1001-0629（2012）03-0411-06

2011-05-06 接受日期：2011-05-25

國(guó)家“十二五”支撐項(xiàng)目（2011BAD17B01）

任小?。?984-），男，河北張家口人，碩士，主要從事牧草種質(zhì)資源研究。E-mail：xiao521gui＠126.com

袁慶華 E-mail：yuanqinghua＠hotmail.com