柳青慕，王赟文，王小山

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

植物生產(chǎn)層

流式細(xì)胞儀快速檢測鴨茅與多花黑麥草染色體倍性的研究

柳青慕1，王赟文1，王小山2

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，北京100193；2.揚(yáng)州大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

以鴨茅（Dactylisglomerata）和多花黑麥草（Loliummultiflorum）不同倍性的種質(zhì)為材料，對流式細(xì)胞儀測定牧草多倍體的技術(shù)方法和結(jié)果進(jìn)行評價，旨在利用流式細(xì)胞儀技術(shù)快速確定供試牧草的染色體倍性。采用根尖染色體計數(shù)法確定鴨茅‘北綠’品種和多花黑麥草‘Mammoth B’品種為四倍體，以這兩個品種的相對核DNA含量和核內(nèi)DNA復(fù)制的平均周期值作為參照，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表明，鴨茅‘早生綠’品種和PI316209種質(zhì)材料為四倍體，種質(zhì)PI237602和PI368880為二倍體，PI316209種質(zhì)的倍性與種質(zhì)背景信息所提供的倍性存在差異；多花黑麥草‘Musashi’品種為四倍體，‘Tachimasari’和‘WasehopeⅢ’兩個品種為二倍體。研究結(jié)果為流式細(xì)胞儀如何在同一物種范圍內(nèi)檢測不同倍性樣品提供了依據(jù)。

鴨茅；多花黑麥草；染色體；倍性；流式細(xì)胞儀

多倍體化在高等植物物種形成過程中具有重要作用，大約70%被子植物起源于多倍體［1］。染色體基數(shù)為7～9的植物進(jìn)化過程涉及到多倍體化［2］。據(jù)鮑文奎等［3］對禾本科107個種的研究，71.96%是多倍體。鴨茅（Dactylisglomerata）和多花黑麥草（Loliummultiflorum）是溫帶叢生型禾本科優(yōu)良栽培牧草，前者為多年生草本植物，原產(chǎn)歐洲，在歐洲一些國家的牧草生產(chǎn)中占有重要地位，同時也是美國大面積種植的牧草［4］，在我國西南各省有野生種質(zhì)分布［5］；后者又叫意大利黑麥草、一年生黑麥草［6］，為一年生植物，在我國也有較大范圍的栽培［7］。鴨茅屬僅含1個種，根據(jù)地理分布、染色體倍性和形態(tài)學(xué)性狀又分為20個亞種［8］。根據(jù)染色體數(shù)目，鴨茅包括二倍體（2n=2x=14）、四倍體（2n= 4x=28）和六倍體（2n=6x=42），其中自然界以二倍體和四倍體為主［9］。多花黑麥草的染色體基數(shù)也為7，自然界均為二倍體，目前栽培品種中有一些是經(jīng)過人工誘導(dǎo)加倍的四倍體多花黑麥草。

染色體計數(shù)與組型分析是傳統(tǒng)的植物染色體倍性鑒定方法，采用一定時期、一定部位的組織細(xì)胞，經(jīng)染色處理制片后在光學(xué)顯微鏡下測定染色體的數(shù)目、染色體外部和內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。植物染色體制片主要包括壓片法和去壁低滲-火焰干燥法。要達(dá)到可準(zhǔn)確鑒別染色體的目的，植物染色體制片對取材時間、部位、染色處理等技術(shù)環(huán)節(jié)的要求較高，特別是同時對大量的樣品進(jìn)行染色體倍性鑒定時，這種傳統(tǒng)的染色體觀測方法就表現(xiàn)出明顯的局限性。流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項技術(shù)，它集計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體?？梢远康販y定某一細(xì)胞中的DNA、RNA或某種特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞數(shù)量。隨著倍性的增加，DNA含量呈倍性增加趨勢，據(jù)此可快速鑒定細(xì)胞的倍性水平。流式細(xì)胞術(shù)不受植物取材部位和細(xì)胞所處時期的限制，制樣簡單、靈敏度、分辨率及準(zhǔn)確性較高，數(shù)據(jù)的可重復(fù)性好，測試速度快，并且DNA含量變異可在分布圖上直觀地表現(xiàn)出來，特別適用于樣品較多的倍性檢測分析。此外，通過測定細(xì)胞核內(nèi)的DNA含量，流式細(xì)胞術(shù)還可以比較不同植物或同一植物不同組織細(xì)胞的基因組變異程度［10］。

雖然目前流式細(xì)胞儀已普遍用于植物倍性研究，國內(nèi)在菊花（Dendranthemamorifolium）［11］和辣椒（Capsicumannuum）［12］等植物的倍性研究上已有使用，但是有關(guān)牧草多倍體流式細(xì)胞術(shù)測定還未有研究報道。本研究以鴨茅和多花黑麥草不同倍性的品種為材料，在根尖組織制片顯微鏡觀測確定染色體數(shù)目的基礎(chǔ)上，對流式細(xì)胞儀測定牧草多倍體的技術(shù)方法和結(jié)果進(jìn)行評價與比較，為今后利用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定大批量牧草樣品的染色體倍性水平提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 參試的種質(zhì)材料共有9個，其中鴨茅種質(zhì)5個、多花黑麥草種質(zhì)4個（表1）。除PI編號的種質(zhì)來自美國植物引種試驗站以外，其余的鴨茅和多花黑麥草種質(zhì)均來自日本草地畜產(chǎn)種子協(xié)會飼料作物研究所。將試驗材料分別在溫室和光照培養(yǎng)箱中育苗和發(fā)芽。溫室育苗時先將100粒種子在直徑30cm，高度25cm的花盆中育苗，待幼苗株高3～5cm時，將單株移植至直徑9cm、高度10cm的花盆中繼續(xù)生長，每個品種移植30個單株，用于根尖染色體計數(shù)和流式細(xì)胞儀測定。光照培養(yǎng)箱發(fā)芽條件為恒溫25℃，培養(yǎng)至根長1cm左右。

1.2 試驗方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀檢測方法 隨機(jī)選取鴨茅‘北綠’和多花黑麥草‘Mammoth B’的溫室種植單株各6株和培養(yǎng)箱發(fā)芽種子6粒，通過壓片法［13］進(jìn)行染色體計數(shù)。具體操作為取這兩份種質(zhì)在溫室栽培的單株材料和光照培養(yǎng)箱萌發(fā)種子的根尖部位0.5cm大小的材料，冰水浴24h后，轉(zhuǎn)入卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定24h，用蒸餾水沖洗后放入1mol·L-1HCl溶液中，在60℃水浴5～7min，蒸餾水沖洗，改良卡寶品紅溶液染色5min，壓片法制片，尼康80i生物顯微鏡鏡檢、拍照。

表1 供試材料及其來源Table 1 Experimental materials and seed source

取上述根尖染色體計數(shù)后的1株溫室種植單株為對照材料，流式細(xì)胞儀進(jìn)一步確定另外5株染色體計數(shù)后的溫室種植單株的染色體倍性水平。具體的操作步驟參照陳斌等［14］的方法，取供試材料的新鮮嫩葉約50mg放入已加入1mL裂解液的培養(yǎng)皿中，用保險刀片切碎，過濾，收集濾液，1 100 r·min-1離心6min后，倒去上清液，向沉降物中加入200μL碘化丙啶（PI）染色液（50μg·mL-1），4℃冰箱中黑暗處理20min后，流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行檢測。檢測中，用已確定染色體數(shù)目的對照材料調(diào)整流式細(xì)胞儀，使對照材料的主峰位于100道附近，由此儀器檢測圖示當(dāng)中，50道、150道和200道附近的峰顯示的細(xì)胞核相對DNA含量分別為100道的1/2、3/2和2倍。

然后以這兩個品種已經(jīng)確定染色體倍性的單株為對照材料對其他供試材料進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀檢測中其他種質(zhì)材料每份材料隨機(jī)檢測6個溫室種植單株，并記錄檢測值的變異系數(shù)。

研究中使用的流式細(xì)胞儀均為北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供的美國BD公司的FACSCalibr流式細(xì)胞儀，同為BD公司的CellQuest軟件獲取數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)用美國Yerity Software House公司的ModFit軟件進(jìn)行分析。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測中的數(shù)據(jù)處理 根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果利用下列公式［15］計算每個供試樣本的周期值（Cycle alue），以確定被檢測植物器官的染色體倍性水平。

式中，n2C、n4C、n8C、…、nXC分別為核相對DNA含量2C、4C、8C、…、XC的細(xì)胞核數(shù)。式中所得的周期值可以表示每個細(xì)胞核核內(nèi)復(fù)制的平均周期數(shù)，當(dāng)檢測一個植物器官時所得周期值大于0.1，則可認(rèn)為其是混倍體或內(nèi)源多倍體（Endoployploidy），即該植物器官是由多種不同倍性水平的細(xì)胞構(gòu)成。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀校準(zhǔn) 對鴨茅‘北綠’品種和多花黑麥草‘Mammoth B’品種供試樣本的的根尖細(xì)胞染色體計數(shù)結(jié)果顯示二者均為四倍體，即2n=4x=28（圖1），確定了其染色體倍性與表1的染色體倍性水平相同。

以經(jīng)根尖細(xì)胞壓片法確定為四倍體的鴨茅‘北綠’和多花黑麥草‘Mammoth B’兩個品種為參照，將其流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果主峰校正在100道，以此為樣品的相對核DNA含量4C檢測值（圖2）。此外，在200道附近還有一個略微明顯的峰，這表示在被檢測樣品中尚有核相對DNA含量8C的細(xì)胞存在，而這份對照材料供試樣品的DNA復(fù)制周期值均小于0.1（表2），表明不存在內(nèi)源多倍體現(xiàn)象。因此，以流式細(xì)胞儀檢測位于100道處出現(xiàn)的峰值為供試樣本G1期（DNA復(fù)制前期）細(xì)胞的相對核DNA含量，200道處則是供試樣品G2期（DNA復(fù)制后期）細(xì)胞的相對核DNA含量。

2.2 參試樣品流式細(xì)胞儀檢測

圖1 鴨茅‘北綠’和多花黑麥草‘Mammoth B’的壓片結(jié)果Fig.1 Chromosome count at metaphase stage of root tip cells inDactylisglomerataKitamidori andLoliummultiflorumMammoth B

2.2.1 鴨茅 在利用鴨茅‘北綠’和多花黑麥草‘Mammoth B’兩個品種對流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)行校準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，對其他鴨茅參試材料的倍性檢測結(jié)果表明，‘早生綠’和PI316209兩份材料的檢測結(jié)果均與‘北綠’品種相同，主峰于100道處，為4C相對核DNA含量的峰（圖3），而且被檢測樣本的周期值都小于0.1（表2），可以確定這兩份材料均為四倍體。前者的檢測結(jié)果與品種信息所提供的倍性水平相一致，而PI316209種質(zhì)材料則與種質(zhì)來源說明不同（表1），應(yīng)為四倍體而不是二倍體。PI368880和PI237602兩份材料的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果包括位于50道的主峰和100道的側(cè)峰，分別代表2C和4C相對核DNA含量的峰（圖3）。因主峰表示2C相對核DNA含量，且主峰峰值遠(yuǎn)大于側(cè)峰，可以確定這兩份材料均為二倍體。其4C相對核DNA含量的峰可能有3個來源，第一，出于細(xì)胞染色體復(fù)制時期的G2期的細(xì)胞；第二，存在內(nèi)源多倍體的可能，即在該材料的葉片中不僅有二倍體的細(xì)胞還有四倍體的細(xì)胞。第三，樣品制備過程中，沒有形成單細(xì)胞狀態(tài)，存在細(xì)胞粘連現(xiàn)象。PI237602檢測的6個樣品當(dāng)中，有5個樣品的周期值大于0.1（表2），而PI36880的檢測樣品中，周期值小于0.1的有2個，大于0.1的為4個（表2），檢測結(jié)果的重復(fù)性較好，不排除葉片中存在內(nèi)源多倍體的可能。

圖2 對照樣品流式細(xì)胞儀檢測值Fig.2 Flow cytometry values fromD.glomerataKitamidori andL.multiflorumMammoth B，which were used as internal standard

表2 供試樣品的周期值Table 2 Cycle values of tested materials

2.2.2 多花黑麥草 參試的3份多花黑麥草材料中，‘Tachimasari’和‘WasehopeⅢ’兩份材料的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果都出現(xiàn)了位于50道附近的主峰和100道附近的側(cè)峰（圖4），表明葉片中存在2C和4C相對核DNA含量的兩種細(xì)胞。因為被檢測樣本位于主峰區(qū)段的檢測細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于側(cè)峰區(qū)段，因此，確定這3份多花黑麥草品種材料均為二倍體，檢測結(jié)果與品種背景信息所提供的染色體倍性水平（表1）相一致。檢測結(jié)果中4C相對核DNA含量峰的來源與2.2.1分析相似。Tachimasari’品種所有6份檢測樣品的周期值都大于0.1，而‘WasehopeⅢ’的6個檢測樣品中，有4份周期值大于0.1（表2），表明它們的葉片細(xì)胞中可能存在內(nèi)源多倍體現(xiàn)象?！甅usashi’品種的檢測結(jié)果顯示在100道和200道附近分別出現(xiàn)主峰和側(cè)峰（圖4），且6份檢測樣品的周期值均小于0.1，確定‘sashi’料為四倍體，與品種材料的背景信息相同。

圖3 參試鴨茅樣品的流式細(xì)胞儀檢測值Fig.3 Flow cytometry values of tested samples fromD.glomerata

2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測的變異系數(shù)和偏峰現(xiàn)象 在流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果中顯示出鴨茅PI237602和PI368880這兩份材料的變異系數(shù)小于品種‘早生綠’和PI316209的變異系數(shù)，多花黑麥草‘Tachimasari’和‘WasehopeⅢ’的變異系數(shù)小于品種‘Musashi’的變異系數(shù)（表3）。表明在流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性檢測時，同一物種中，染色體倍性低的試驗材料的變異系數(shù)要小于染色體倍性高的試驗材料的變異系數(shù)。

流式細(xì)胞儀檢測中一些樣品的峰位發(fā)生了向左或者向右偏移的現(xiàn)象，即偏峰現(xiàn)象（圖3），且四倍體材料的偏移大于二倍體材料。

3 討論

流式細(xì)胞儀檢測常用的熒光染料包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）和溴化乙錠（EB）等，其中DAPI、EB等與DNA上的G-C堿基對可以發(fā)生特異性結(jié)合。與這些熒光染料不同，PI與DNA的結(jié)合無堿基特異性［16］，其熒光可以被488nm的激光器檢測到，因此適用于絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀，在使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行植物核DNA含量測定時，PI是最常用的熒光染料［17］。核DNA含量和染色體數(shù)之間存在著線性關(guān)系［18］，PI染色后，相同植物種的四倍體材料發(fā)出的熒光信號強(qiáng)度是二倍體材料的2倍，從而實現(xiàn)不同倍性材料的鑒別，檢測的靈敏度較高。本研究進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測中，采用的熒光染料為PI，樣品前處理采用提取液中保險刀片切碎組織的方法［19-20］，處理速度快，平均處理每份材料用時30s。Georgiev等［21］認(rèn)為流式細(xì)胞儀檢測的變異系數(shù)在9%以內(nèi)，其檢測結(jié)果就比較可靠。本研究的檢測結(jié)果變異系數(shù)均小于4%，說明利用流式細(xì)胞儀快速檢測鴨茅和多花黑麥草葉片細(xì)胞的染色體倍性是可行的。

表3 流式細(xì)胞儀檢測中供試樣品的變異系數(shù)Table 3 Coefficient of variation values of tested samples by flow cytometry%

Arumuganathan和Earle［22］認(rèn)為流式細(xì)胞儀檢測時，單份樣品的質(zhì)量最好不超過50mg，如果樣品量過高，則影響檢測結(jié)果。當(dāng)對照樣品與檢測樣品屬于不同的物種時，為便于結(jié)果分析和控制誤差，在流式細(xì)胞儀測定核DNA含量、細(xì)胞周期和植物倍性的研究中，可以將對照樣品與待測樣品混合后在相同的條件下進(jìn)行處理和檢測［16］。本研究的目的是檢測相同物種不同的倍性材料，若將對照樣品與待測樣品混合后處理和檢測，則發(fā)生峰位重疊，檢測結(jié)果難以分析，此外樣品量也會相應(yīng)的提高。因此，檢測相同物種不同的倍性材料時，分別檢測的效果要優(yōu)于二者混合處理和檢測。

流式細(xì)胞儀檢測植物材料的研究表明，檢測樣品的倍性水平對結(jié)果的變異系數(shù)有一定的影響，同一植物物種中低倍性材料的變異系數(shù)小于高倍性材料的變異系數(shù)。本研究中，不論鴨茅還是多花黑麥草的四倍體材料變異系數(shù)均大于二倍體材料。究其原因，高倍性植物材料的細(xì)胞體積較大，細(xì)胞內(nèi)含物較多，在細(xì)胞核提取的過程中混入的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)會比低倍性的植物材料多。

偏峰現(xiàn)象是流式細(xì)胞儀檢測中的一種常見現(xiàn)象，屬于檢測誤差。Farnham等［23］認(rèn)為，樣品熒光染色后放置的時間太長就會導(dǎo)致偏峰現(xiàn)象出現(xiàn)，這種現(xiàn)象通過樣品的重復(fù)檢測和縮短熒光染色后樣品放置的時間有時可以消除［24］。因本研究采用對照樣品與待測樣品分開檢測的方法，為消除或降低偏峰現(xiàn)象的發(fā)生程度，在每檢測10個樣品后，用對照樣品調(diào)整峰位，起到了一定的效果。根據(jù)流式細(xì)胞儀自身的靈敏度和參數(shù)特性，通常認(rèn)為被檢測樣品的峰位向左、向右偏移10～20道屬于正常允許誤差范圍。當(dāng)峰位偏移過多，且重復(fù)檢測及重新調(diào)整對照樣品峰位也不能消除時，則說明檢測結(jié)果的差異來自被檢測樣品的倍性差異。

種子植物中，內(nèi)源多倍體現(xiàn)象是植物生長發(fā)育過程中的一種常見現(xiàn)象［25］，它是由植物體細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制引起的，核內(nèi)復(fù)制是指細(xì)胞核內(nèi)DNA不斷合成而細(xì)胞不分裂的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在植物體細(xì)胞分化過程中很常見［26-27］。利用流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果計算相應(yīng)的周期值可以在一定程度上衡量上述現(xiàn)象在植物器官中的發(fā)生概率。周期值這一計算公式是根據(jù)未經(jīng)倍性誘導(dǎo)加倍和環(huán)境脅迫處理的情況下，同一時間、同一器官中活化分裂期細(xì)胞的百分含量來定義的。Barow［27］和Castro等［24］的研究都證明內(nèi)源多倍體現(xiàn)象在植物中普遍發(fā)生，且在不同植物器官中這種現(xiàn)象發(fā)生的概率不同，與植物種類有關(guān)。本研究的參試材料當(dāng)中，鴨茅PI237602與PI368880材料，以及多花黑麥草‘Tachimasari’和‘WasehopeⅢ’品種，葉片中可能存在少量不同倍性的細(xì)胞，即具有內(nèi)源多倍體現(xiàn)象。內(nèi)源多倍體的表象在二倍體材料中發(fā)生的機(jī)率高于四倍體材料。這種內(nèi)源多倍體的真實性、發(fā)生原因及其生物學(xué)作用還有待進(jìn)一步的研究。

致謝：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院郭仰東教授、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心的劉凡、張逸云老師在流式細(xì)胞儀檢測中提供了幫助，在此致以誠摯謝意。

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Detection of chromosome ploidy level in Dactylis glomerata and Lolium multiflorumby flow cytometry

LIU Qing-mu1，WANG Yun-wen1，WANG Xiao-shan2
（1.Department of Grassland Science，College Animal Science &Technology of China Agricultural University，Beijing 100193，China；2.College Animal Science &Technology of Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

A practice of detecting chromosome ploidy levels inDactylisglomerataandLoliummultiflorumby a flow cytometry method was reported；and aimed to discuss its application and reliability in forage polyploidy research.In order to investigate the chromosome ploidy levels of 4D.glomeratagermplasms（Wasemidori，PI316209，PI237602and PI36880）and 3L.multiflorumcultivars（Musashi，Tachimasari and WasehopeⅢ）by using the flow cytometry method，two known tetraploidy cultivars，includingD.glomeratacv.‘Kitamidori’andL.multiflorumcv.‘Mammoth B’，were used as control materials. Their chromosome number in root tissue cells were double checked by the optical method and used to set a standard value in a flow cytometry.The results indicated that both of‘Wasemidori’and‘PI316209’inD.glomeratawere tetraploids，but‘PI237602’and‘PI36880’were diploids.For 3testedL.multiflorumcultivars，‘Musashi’was tetraploid，while‘Tachimasari’and‘WasehopeⅢ’were diploids.All chromosome ploidy levels of the tested cultivars or germplasms were confirmed to their known ploidy levels except of‘PI316209’inD.glomerata，which was a tetraploid instead of a diploid.The results provided a good reference to detect various chromosome levels in a same species by the flow cytomety method.

Dactylisglomerata；Loliummultiflorum；chromosome；ploidy level；flow cytometry

WANG Yun-wen E-mail：wyw＠cau.edu.cn

S543.03；Q943

A

1001-0629（2012）03-0403-08

2011-04-26 接受日期：2011-07-14

國家“十一五”科技支撐計劃課題牧草倍性育種技術(shù)研究（2008BADB3B03）

柳青慕（1986-），女，遼寧遼陽人，在讀碩士生，研究方向為牧草育種與生物技術(shù)。E-mail：290021748＠qq.com

王赟文 E-mail：wyw＠cau.edu.cn