鄒莉 譚昀 楊民寶 孫婷婷

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

樺褐孔菌(Inonotus obliguus(Pers.:Fr.)Pilát)屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，是一種重要的藥用真菌[1]。民間廣泛用于防治消化道疾病、心血管疾病和腫瘤(胃癌、腸癌及肝癌)等[2]，臨床上用于治療糖尿病、高血壓、癌癥、衰老、傳染性病毒等，取得顯著的效果[3]。樺褐孔菌成分復(fù)雜，含有多糖、三萜類化合物、葉酸衍生物、芳香族香草酸、生物堿等活性物質(zhì)[4－5]。化學(xué)研究表明，多糖、香草酸、生物堿有抑菌活性[6－7]。有關(guān)真菌的活性成分在病原菌防治方面的研究主要以木霉為主[8]，木霉的抑菌作用及機(jī)制已被廣泛研究[9]，而關(guān)于樺褐孔菌的抑菌研究少見報(bào)道。為探索樺褐孔菌的活性物質(zhì)對(duì)植物病原菌的影響，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，筆者對(duì)其抑菌效果及對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究，為樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樺褐孔菌由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基:PDA 固體培養(yǎng)基[10]46－47，PD 液體培養(yǎng)基[10]46－47。所有培養(yǎng)基在 121 ℃ 下滅菌 30 min備用。

供試植物病原菌:楊樹爛皮病菌(Cytospora chrysosperma)、落葉松枯梢病菌(Botryosphaeria laricina)由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)學(xué)科病理實(shí)驗(yàn)室提供;玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、番茄褐斑病菌(Helminthosporium carposaprum)、番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)科提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵產(chǎn)物抑菌率的測(cè)定

將樺褐孔菌液體種子以20%的接種量，接入200 mL液體PD培養(yǎng)基中，150 r/min，25℃避光培養(yǎng) 9、12、15、17、19、20、23、25、27、29 d。采用菌絲生長(zhǎng)速率法[10]141測(cè)定樺褐孔菌不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)7種供試病原菌的抑制作用:將200 μL的發(fā)酵產(chǎn)物加入每個(gè)PDA培養(yǎng)基，對(duì)照加入無(wú)菌水，用直徑6 mm的打孔器在各病原菌活化后的培養(yǎng)基上打孔取菌餅，接入上述培養(yǎng)皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)72 h，每隔24 h觀察1次，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每處理設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算樺褐孔菌不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率。

抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.2.2 樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物活性物質(zhì)提取

1.2.2.1 菌絲體的活性物質(zhì)提取

將抑菌率最高的發(fā)酵液離心分離菌絲體，將菌絲體沖洗干凈后60℃烘干，粉碎后過60目篩備用。①菌絲體粉末的抑菌活性測(cè)定:將預(yù)處理的菌絲體粉末按比例加入PDA培養(yǎng)基中，高溫濕熱滅菌，接入病原菌，以不加菌絲體粉末的PDA平板培養(yǎng)基為對(duì)照，培養(yǎng)72 h。測(cè)定菌絲體粉末的抑菌活性。②菌絲體有機(jī)溶劑萃取物的抑菌活性測(cè)定:將經(jīng)過預(yù)處理的菌絲體用正丁醇和乙酸乙酯在78℃下進(jìn)行索氏抽取8 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥后用丙酮配置成一定濃度的樣品液，濾膜過濾除菌后采取平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。③菌絲體水溶多糖的抑菌活性測(cè)定:取1 g干菌絲體粉末加定量熱水浸提，浸提液合并后濃縮至原體積的1/4，下層清液置透析袋，蒸餾水透析2 d，流水透析1 d，用3倍95%乙醇沉淀[12]，沉淀物用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得菌絲體水溶性粗多糖。將收集到的菌絲體水溶性粗多糖按比例溶解在無(wú)菌蒸餾水中，用無(wú)菌濾膜過濾，制成水溶性粗多糖溶液，采用平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。

1.2.2.2 發(fā)酵液的活性物質(zhì)提取

發(fā)酵上清液直接抑菌活性測(cè)定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液不經(jīng)任何處理，用平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

高溫高壓滅菌發(fā)酵上清液的抑菌活性測(cè)定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液經(jīng)高溫高壓濕熱滅菌后，采用平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

發(fā)酵上清液有機(jī)溶劑萃取物的抑菌活性測(cè)定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液減壓濃縮至原來體積的1/2，分別用5倍體積的正丁醇，3倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為24 h。之后用分液漏斗分離萃取相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得固體樣品，真空干燥后用丙酮配置成一定濃度的樣品液。濾膜過濾除菌后采取平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

發(fā)酵上清液醇提物的抑菌活性測(cè)定:將離心去除菌絲的發(fā)酵上清液加入3倍體積的95%乙醇，4℃下靜止12 h，有絮狀沉淀出現(xiàn)，冷凍干燥得到沉淀物，然后放置于干燥器中進(jìn)一步干燥，得到發(fā)酵上清液醇提物干品。將醇提物用無(wú)菌水按比例溶解，用無(wú)菌濾膜過濾，制成水溶性粗多糖溶液，采用平板表面涂抹法[11]進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

1.2.3 樺褐孔菌發(fā)酵液抑菌活性多糖的純化及最小抑菌質(zhì)量濃度的測(cè)定

對(duì)抑菌率最高發(fā)酵周期的發(fā)酵液粗多糖進(jìn)行分級(jí)純化，參照文獻(xiàn)[13－15]并加以調(diào)整，采用95%乙醇對(duì)粗多糖進(jìn)行分級(jí)沉淀。取一定質(zhì)量粗多糖溶于適量的水中，邊攪拌邊加入95%的乙醇，使乙醇的最終體積分?jǐn)?shù)為:30%、50%、70%、90%。在6000 r/min、4℃離心，收集沉淀，冷凍干燥沉淀得到分級(jí)醇沉的多糖干品。醇沉分級(jí)純化的多糖按乙醇最終體積分?jǐn)?shù)分類，分別用無(wú)菌蒸餾水溶解配置成 50 g·L－1的粗多糖溶液，0.22 μm 無(wú)菌濾膜過濾。采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定各級(jí)別多糖的抑菌率，比較抑菌率，篩選出抑菌活性最強(qiáng)的多糖，用半倍稀釋法[16]73、懸滴法[16]72測(cè)定抑菌活性多糖對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的最低抑制質(zhì)量濃度。以生物農(nóng)藥兒茶素作為影響菌絲生長(zhǎng)的對(duì)照，以無(wú)菌水作為孢子萌發(fā)的對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌率最高的樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵周期

樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制活性見圖1。由圖1可知，樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)7種病原菌均有抑制作用，抑菌率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸升高，至第23天發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性最強(qiáng)，到25 d后基本保持穩(wěn)定。因此，可以確定樺褐孔菌分離和純化抑菌活性物質(zhì)最佳發(fā)酵周期為23 d。樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)楊樹爛皮病和落葉松枯梢病的抑菌率超過了50%，因此研究其發(fā)酵產(chǎn)物所含抑菌活性物質(zhì)對(duì)抑制楊樹爛皮病和落葉松枯稍病具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

圖1 Inonorus obliguus發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制活性的影響

2.2 樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物不同處理的抑菌率比較

樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期發(fā)酵產(chǎn)物的不同處理對(duì)楊樹爛皮病、落葉松枯稍病的抑菌活性比較如表1所示?？梢钥闯觯瑯搴挚拙l(fā)酵上清液醇提物對(duì)楊樹爛皮病、落葉松枯稍病抑菌活性均較強(qiáng)，其次為發(fā)酵上清液、滅菌后的發(fā)酵上清液，其中發(fā)酵上清液不同處理的抑菌活性均強(qiáng)于化學(xué)試劑萃取組分，可見樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中的主要抑菌活性物質(zhì)存在于發(fā)酵上清液的醇提物中。

表1 樺褐孔菌最佳發(fā)酵周期發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

2.3 樺褐孔菌抑菌活性多糖的分級(jí)純化

醇沉最終體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%時(shí) ，多糖得率分別為1.41% 、2.51% 、10.05% 、2.04%。不同醇沉體積分?jǐn)?shù)多糖的得率區(qū)別較大，隨著醇沉最終體積分?jǐn)?shù)的增大樺褐孔菌多糖的得率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最高，之后隨著體積分?jǐn)?shù)增大多糖得率逐漸減小。結(jié)果表明，樺褐孔菌的最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.4 樺褐孔菌分級(jí)純化抑菌活性多糖的抑菌效果

不同醇沉級(jí)別的樺褐孔菌多糖對(duì)病原菌的抑菌率見表2。為了避免出現(xiàn)偏差，在對(duì)抑菌活性多糖分級(jí)后抑菌活性比較中將供試的7種病原菌都作了測(cè)試。結(jié)果表明:醇沉級(jí)別為70%的樺褐孔菌多糖(質(zhì)量濃度為50 g·L－1)對(duì)病原菌的抑菌率最高。70%的樺褐孔菌多糖對(duì)楊樹爛皮病和落葉松枯梢病抑菌率為供試組中最高的，分別為54.65%、67.41%。

表2 不同醇沉級(jí)別的樺褐孔菌多糖對(duì)病原菌的抑菌率%

2.5 樺褐孔菌多糖的最小抑菌質(zhì)量濃度

醇沉級(jí)別為70%的樺褐孔菌多糖對(duì)楊樹爛皮病和落葉松枯稍病菌絲生長(zhǎng)的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為65、60 g·L－1;兒茶素對(duì)楊樹爛皮病和落葉松枯稍病菌菌絲生長(zhǎng)的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為75、55 g·L－1，抑制效果見圖2和圖3。

醇沉級(jí)別為70%樺褐孔菌發(fā)酵液多糖對(duì)楊樹爛皮病孢子無(wú)明顯的抑制作用，對(duì)落葉松枯稍病的孢子有較明顯的抑制作用，當(dāng)其質(zhì)量濃度為55 g·L－1時(shí)能抑制50%的孢子萌發(fā)(圖4)，這可能與病原菌孢子的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖2 樺褐孔菌最小抑菌質(zhì)量濃度對(duì)楊樹爛皮病的抑制效果

圖3 樺褐孔菌最小抑菌質(zhì)量濃度以及生物農(nóng)藥對(duì)落葉松枯稍病的抑制效果

圖4 樺褐孔菌對(duì)落葉松枯稍病孢子的影響以及無(wú)菌生理鹽水對(duì)照(右)

3 結(jié)論與討論

樺褐孔菌是目前抗癌研究領(lǐng)域的熱門藥用品種。到目前為止，對(duì)樺褐孔菌的研究大多集中在抗腫瘤和提高機(jī)體免疫能力方面，而關(guān)于樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性很少報(bào)道。本研究證明了它對(duì)7種植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有抑制作用。已證實(shí)，樺褐孔菌發(fā)酵上清液的乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有抑菌活性，其發(fā)酵上清液醇提物對(duì)楊樹爛皮病、落葉松枯稍病抑菌活性均較強(qiáng)，由此推斷，樺褐孔菌抑菌活性物質(zhì)主要存在于菌絲體醇提取物中。通過對(duì)活性成分的初步檢測(cè)，樺褐孔菌菌絲體甲醇、正丁醇提取物中主要含有多糖類物質(zhì)。因此，樺褐孔菌菌絲體中所含的多糖類物質(zhì)可能具有較高的抑菌活性。而發(fā)酵液所表現(xiàn)出來的抑菌作用可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類活性物質(zhì)有關(guān)，也可能是由于液體發(fā)酵時(shí)菌絲斷裂而產(chǎn)生抗生素或釋放出了抗生素物質(zhì)，對(duì)于樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。由于病原菌只選用了7種，故不能確定其對(duì)未測(cè)試的病原菌有無(wú)抑制活性。

關(guān)于桑黃抑菌的研究已有過報(bào)導(dǎo)，2011年孟慶龍等研究了桑黃發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌作用[17]，試驗(yàn)中選取的病原菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌，本研究在此基礎(chǔ)上擴(kuò)展了樺褐孔菌對(duì)其他7種植物病原菌的抑制作用研究，對(duì)于樺褐孔菌活性物質(zhì)的提取方法，本研究也分別對(duì)發(fā)酵液和菌絲體采用了多種不同的試劑提取，得出的結(jié)果與孟慶龍的結(jié)論相似，但較之其研究有了進(jìn)一步的深化。

多糖作為真菌的發(fā)酵產(chǎn)物之一，已有不少關(guān)于其抑菌活性的報(bào)導(dǎo)，例如靈芝多糖[18]，紅菇菌多糖[19]，粒毛盤菌和盤針孢菌多糖[20]等。在樺褐孔菌與生物農(nóng)藥的最小抑菌質(zhì)量濃度的對(duì)比中發(fā)現(xiàn):分離出的多糖是一類分子量相近、結(jié)構(gòu)不同的多糖混合物，如果分離出起主要抑菌作用的多糖分子，抑菌效果一定會(huì)大大提高。本試驗(yàn)下一步將對(duì)樺褐孔菌菌株進(jìn)行大量發(fā)酵，進(jìn)一步優(yōu)化菌株的發(fā)酵條件，改進(jìn)和優(yōu)化抑菌活性物質(zhì)的提取技術(shù)，從其代謝產(chǎn)物中分離和提取出具有殺菌活性成分的化合物，并對(duì)分離出的化合物進(jìn)行活性測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定，以進(jìn)一步確定發(fā)酵液中抗菌活性物質(zhì)的組分及相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以期能得到高活性的新化合物。

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